2013 Fiscal Year Research-status Report
BmMLVの安定的遺伝子発現機構の解明と遺伝子発現ベクターの開発
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25450482
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
岩永 将司 宇都宮大学, 農学部, 准教授 (40400717)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | マキュラウイルス / カイコ / 培養細胞 / BmMLV / 持続感染 / チモウイルス |
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| Research Abstract |
Bombyx mori macula-like virus(BmMLV)は、カイコ培養細胞から発見された新規の持続感染型RNAウイルスであり、無病徴の持続感染型の増殖様式を有するウイルスである。そこで本研究ではBmMLVの増殖メカニズムを解明することで、本ウイルスを新たな外来タンパク質発現ベクターとして利用することを目指す。
本年度はまず、BmMLVのサブゲノミックプロモーターの同定を試みた。BmMLVの属するチモウイルス科にはサブゲノミックプロモーター領域に特有のTymo-Box、或いはMarafi-Boxが存在することが知られている。しかしながら、BmMLVのサブゲノミックプロモーターと推定される領域には、上述のような既知配列に相同性を示す領域を見出すことは出来なかった。次に、サブゲノミックプロモーターと推定される領域の二次構造予測を行った結果、複数のステム・ループ構造が存在することが予測された。そこで、これらの領域を1000、500、200、50塩基有し、その下流にホタルルシフェラーゼを連結したプラスミドDNAを構築し、BmMLV陽性細胞へと導入した結果、50塩基の領域で十分なプロモーター活性を有することを明らかにした。更に、その領域には6塩基のステム構造からなる二次構造が存在することが予測されたため、ステムの長さを徐々に短くする変異導入を行った結果、プロモーター活性が顕著に低下することを明らかにした。この結果は、見出した二次構造がプロモーター活性に重要な働きを有することを示しており、外来タンパク質発現の為のプロモーターとして有効である可能性を示している。今後、ループ構造に変異導入を施すだけでなく、逆にステムの領域を大きくすることでより強力なプロモーター活性を持つことが出来るのか調査する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、持続感染型のRNAウイルスであるBmMLVを外来タンパク質発現ベクターとして利用することを目的としている。そのため、目的のタンパク質の発現量を左右するプロモーター領域の特定、またその改良は非常に重要である。
本年度は、このプロモーターの候補として、50塩基のサブゲノムプロモーター領域を同定した。同定したプロモーターには一つのステム・ループ構造が存在したことから、この二次構造がプロモーター活性に与える影響を調査した結果、少なくともステム領域が重要であることが明らかとなった。
一方で、本年度はBmMLVのcoat protein（cp）領域を他の有用遺伝子に置換するため、BmMLVの感染性クローンであるpHMLVのcp領域へマルチクローニングサイトを挿入するなど予備的なplasmidの構築を行った。これらplasmid DNAを元に、次年度、タグや有用遺伝子の挿入を試みる予定である。
更に、本ウイルス陰性の培養細胞株BmVFについて、バキュロウイルス発現系で十分な発現量や翻訳後修飾、細胞外分泌が行われるかどうか調査し、BmVF細胞の有用性を改めて確認することが出来た。これらはBmMLVとBmVF細胞を利用した外来タンパク質発現系においても、翻訳後修飾などが適切になされ、生理活性を有する組換えタンパク質が生産される可能性を示している。以上より、本年度は、概ね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は①サブゲノミックプロモーターの強化と、本プロモーターを利用した遺伝子発現系の開発、②BmMLVのゲノム末端領域の構造を利用したrepliconの構築、③RNA-seqによるBmMLV感染応答遺伝子の網羅的探索を進める。①に関しては、同定したサブげのミックプロモーターのステム構造をより大きなものにするなどし、適宜レポーターアッセイを組み合わせながら条件を最適化したい。②については、ゲノムの複製に必須となる末端構造に着目し、これらを含むBmMLVのrepliconの構築を目指す。③については、ウイルス感染後経時的にサンプリングしたBmVF細胞からRNAを抽出し、次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を行う。これらによってｍウイルス感染に応答する宿主遺伝子を網羅的に探索する予定である。
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