2013 Fiscal Year Research-status Report
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25460038
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
中村 照也 熊本大学, 生命科学研究部, 助教 (40433015)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | DNA修復 / DNA複製 / 構造生物学 |
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| Research Abstract |
本研究対象のDNA酸化損傷の修復に関わるDNAグリコシラーゼは，DNA複製の主要因子PCNAとの相互作用を介して，複製と共役したDNA修復を行う．本研究では，DNAグリコシラーゼが細胞内で実際に働く姿である機能型修復複合体をＸ線結晶構造解析により決定し，複製と共役したDNA修復過程において，DNAグリコシラーゼがどのようにして損傷部位へリクルートされ，正しく塩基除去修復を行うのかという動作機序を構造学的に解明する．
本年度は，2次構造予測を基に作成したDNAグリコシラーゼの発現コンストラクト，野生型および変異型PCNAを用いて精製・結晶化実験を行った．これまでDNAグリコシラーゼ単独では，結晶化実験に用いる上で安定性が問題となっていた．DNAグリコシラーゼ複合体を形成させる際，野生型・変異型PCNAおよび種々の長さ，損傷塩基を用いたDNAを検討することで，最終精製のゲルろ過において，複合体での精製を行うことができた．このサンプルを動的光散乱で解析したところ，単分散である結果を得た．現在，微量結晶化装置を用いて広範に結晶化条件の検討を行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで精製が困難であったDNAグリコシラーゼを結晶化に適した質で調製することに成功しており，おおむね順調に研究は進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
現在扱っているような3元複合体では，それぞれのタンパク質の発現領域の検討，変異の導入に加え，DNAの配列や長さが結晶調製の鍵となる．これらの検討を行い，結晶化を進めていく．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度は，当初の計画よりも少ない検討項目でタンパク質複合体調製において，最適な条件を見いだすことができ，スムーズに研究を実施できた．来年度は結晶化実験が重点となり，試薬など費用がかかるため，そのための補充と考えている．
来年度行う結晶化実験を中心に使用する．しかしながら，結晶を得るには精製条件の再検討が必要となることもあるため，柔軟に対応する．
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