グリオーマ癌幹細胞選択的遺伝子発現システムの構築による新規脳腫瘍治療戦略

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460049
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 丸山 正人 関西医科大学, 医学部, 講師 (00399445)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 癌幹細胞 / グリオーマ

Research Abstract

神経膠腫（グリオーマ）は、脳腫瘍の中で最も多く見られる悪性腫瘍で、治療後の予後も悪い。近年、腫瘍治療後の転移・再発の原因として、癌幹細胞の存在が注目されており、本研究課題では、癌幹細胞をターゲットとした新規治療法の開発を目指している。本年度は、グリオーマ由来癌細胞株における癌幹細胞の同定を行った。
癌幹細胞は、血清不含の神経幹細胞培養培地で培養すると、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成して増殖することが知られている。そこで、ヒトグリオーマ由来細胞株U87MG及びラットC6グリオーマ細胞株を用いて、スフェロイド形成能を調べた。その結果、U87MG及びラットC6グリオーマでspheroid形成が確認できた。U87MG細胞由来癌幹細胞を単離するため、フローサイトメーターを用いて、96穴プレート1wellあたり１個の細胞を播種し、単一細胞に由来するスフェロイド形成を試みた。その結果、約2.5%のU87MG細胞が、スフェロイドを形成した。そこで、これらの細胞を増殖させ、癌幹細胞のクローン化を行った。一方で、癌幹細胞は、Hoechst33342色素を用いて染色後、フローサイトメーターを用いて二次元展開すると、SP (Side Population) 画分として単離されることが知られている。そこで、U87MG細胞を用いて、SP解析を行ったところ、本細胞にはSP画分が存在しないことが明らかとなった。次年度では、クローン化させたU87MG細胞の腫瘍形成能や癌幹細胞マーカーとして知られている分子の発現やその役割について検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本申請課題を達成するためには、癌幹細胞を単離する方法を確立しておくことが必要である。これまでに、フローサイトメーターを用いてSP細胞を回収する方法がよく試みられており、腫瘍組織からの初代培養細胞を用いた系では多くの報告がある。しかしながら、細胞株を用いた報告は少なく、実際、ヒトグリオーマ由来細胞株で試した結果、安定してSP細胞を分画することはできなかった。そこで、癌幹細胞を単離・培養する方法としてシングルセルソートを用いたスフェロイド形成法を採用した結果、単一細胞由来の継代培養可能なスフェロイドを単離することに成功した。これにより、今後、効率的に研究を展開できる。

Strategy for Future Research Activity

今後は、樹立した単一細胞由来スフェロイドをクローン化した癌幹細胞株として使用し、クローン化する前の通常培養している癌細胞と腫瘍形成能・発現遺伝子・マーカー分子の発現などについて検討する。