2013 Fiscal Year Research-status Report
脱リン酸化を介したオートファジーアテニュエーションシステムの統合的理解
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25460063
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
荒木 保弘 東京工業大学, フロンティア研究機構, 特任助教 (60345254)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | オートファジー / ホスファーゼ / タンパク質分解系 / キナーゼ |
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| Research Abstract |
オートファジーは真核生物に普遍的に備わる大規模なタンパク質分解系である。オートファジーは生体内物質のリサイクルシステムとしての機能を持っており、外部の栄養環境によって活性が制御される。その際、関連因子のリン酸化や脱リン酸化がその誘導あるいは抑制のスイッチとして機能している。オートファジー制御に必須な二つのタンパク質キナーゼTorとAtg1が同定されているのに対し、脱リン酸化に関与するタンパク質ホスファターゼについては、未だに知見が得られていない。
オートファジー関連因子Atg13は富栄養条件下でTorキナーゼにより高度にリン酸化されている。この修飾はオートファジー活性の抑制に寄与する。逆に、飢餓時ではAtg13は脱リン酸化されるが、その脱リン酸化を担うホスファターゼは未同定である。従って、本年度ではオートファジー活性状態を司るAtg13のリン酸化制御に関与するホスファターゼの同定を目的とした。
Atg13のリン酸化状態に異常を生じる酵母変異株を探索した結果、PP2Aホスファターゼ不全株では、飢餓時にAtg13が高度にリン酸化されていた。また、遺伝学的解析より、この変異株では、飢餓時にAtg13はTorではなくAtg1キナーゼによりリン酸化されることが示唆された。さらに精製標品を用いた試験管内アッセイでもAtg13がAtg1の基質となったことから、生体内においてAtg13がAtg1キナーゼの直接の標的であることが明らかとなった。以上の結果から、野生株においてはオートファジー誘導条件下で活性化されたAtg1がAtg13をリン酸化する一方で、PP2AがAtg1キナーゼに拮抗したホスファターゼとして、Atg13の脱リン酸化状態を維持していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
オートファジーによる分解は非特異的かつバルクであることから、その制御の破綻から生じる過剰なオートファジーの亢進は死に至ることもありうる、生物にとって由々しき問題である。従って、生物はオートファジーを適度に維持する機構、栄養素の再添加時にはオートファジーを迅速に終息させる機構（オートファジーアテニュエーションシステム）を備えているに違いないが、これらに関する知見、特に分子的基盤を明らかにする研究はほぼ皆無である。上記の背景をもとに、本研究では、上記オートファジー関連キナーゼに拮抗するホスファターゼの単離・同定、それらの活性制御を解明することで、オートファジーに対して負に機能するオートファジーアテニュエーションシステムの理解を目的としている。
ホスファチジルイノシトール3リン酸を産出するPI3キナーゼはオートファジーに参画しており、Vps34は活性触媒サブユニットである。申請者はこれまでにVps34が生体内に於けるAtg1キナーゼの基質の一つであり、リン酸化がオートファゴソーム形成に必須であること、栄養再添加によるオートファジー終息時にVps34は脱リン酸化されることを見出した（投稿準備中）。 従ってVps34の脱リン酸化に寄与するホスファターゼがオートファジーアテニュエーションシステムの中心として機能する可能性が示唆される。
本年度、ホスファターゼ欠失酵母株を多数探索することにより、リン酸化Atg13のホスファターゼとしてPP2Aを同定した。またAtg13がAtg1キナーゼの基質となりうることも明らかにした。タンパク質キナーゼとそれに拮抗するホスファターゼの多くが対をなすことから、Atg1によりリン酸化されるVps34 の脱リン酸化酵素としてPP2Aが機能していることが予想される。これらはオートファジーアテニュエーションシステムの理解への端緒を開く知見となったと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
オートファジーアテニュエーションへのPP2Aの関与を、PP2A欠失株を用いたALPアッセイ、GFP-Atg8切断アッセイにより検証する。またAtg13、Vps34のリン酸化部位をアスパラギン酸やグルタミン酸に置換したリン酸化模倣変異体がホスファターゼ変異体と類似の表現型を示すかを検証し、オートファジーアテニュエーションシステムにおける脱リン酸化の意義を検証する。
PP2Aタンパク質ホスファターゼはAtg13、Vps34以外のオートファジー関連タンパク質も基質とし、オートファジーアテニュエーションに寄与していることが考えられる。従って、候補ホスファターゼの基質タンパク質を網羅的に同定することでオートファジーアテニュエーションシステムの全体像の解明が可能になると考えられる。同時にホスファターゼの基質の中から新規オートファジー関連タンパク質の同定も視野に入れる。基質の網羅的同定は以下のストラテジーに依る。定量的リン酸化プロテオームによるPP2A変異株と野生株間のリン酸化タンパク質の包括的比較を行い、変異株でリン酸化に異常が見られるタンパク質を同定する。これらにより、オートファジーアテニュエーションに寄与するVps34以外の基質タンパク質を余すことなく単離する。
PP2Aがオートファジーアテニュエーションシステムに関与しないことが判明した場合、真のVps34を基質とするホスファターゼを生化学的手法により同定する。即ち、出芽酵母の全てのホスファターゼの活性消失変異体を作製し、リン酸化Vps34と相互作用するホスファターゼを免疫沈降法で同定する。リン酸化Vps34を基質とするホスファターゼが複数存在する場合でも全てを同定できると考える。
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