2013 Fiscal Year Research-status Report

新規分泌性因子Ｎｅｕｄｅｓｉｎの高脂肪食誘導肥満形成における役割の解明

Research Project

Project/Area Number	25460065
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	伊藤信行京都大学, 薬学研究科(研究院), 名誉教授 (10110610)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	分泌性タンパク質 / マウス / 遺伝子欠 / 肥満 / エネルギー代謝
Research Abstract	1. Neudesin KOマウスにおける肥満誘導性の脂肪肝・インスリン抵抗性に関す検討血中パラメーターを測定した結果、Neudesin KOマウスでは高脂肪食による血糖値・血中インスリン濃度の増加が抑制されていた。また、グルコース負荷試験・インスリン負荷試験を行った結果、Neudesin KOマウスで肥満によるインスリン抵抗性の出現に改善が見られた。さらに、高脂肪食飼育による肝臓への中性脂肪の蓄積がNeudesin KOマウスでは殆ど認められなかった。これらの結果から、Neudesin KOマウスが肥満誘導性のインスリン抵抗性の出現や脂肪肝の発症に強い耐性を示すことが明らかとなった。 2. 高脂肪食飼育時のNeudesin KOマウスにおけるエネルギー摂取・消費に関する検討高脂肪食飼育時の摂食量にはジェノタイプ間の変化が認められなかった (Fig. 3A)。また、Neudesin KOマウスは自発行動量が変化していなかったにも関わらず、体温の上昇が認められた。このことから、Neudesin KOマウスでエネルギー消費が増加している可能性が考えられた。そこで、エネルギー消費を評価するためにそれぞれのマウスの呼気ガスを測定した。その結果、Neudesin KOマウスではエネルギー消費の指標となる酸素消費量が増加していた。また、基質利用の指標となる呼吸商の値が減少傾向を示したことから、Neudesin KOマウスは消費するエネルギーの基質として脂質を活発に利用している可能性が示唆された。そのため、脂肪酸酸化量を算出した結果、Neudesin KOマウスで脂肪酸酸化が亢進していた。これらの結果から、Neudesin KOマウスで肥満が抑制される原因として、エネルギー消費の増加が関与することが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究実績の概要に記載した通り、Neudesin KOマウスが肥満誘導性のインスリン抵抗性の出現や脂肪肝の発症に強い耐性を示すことを明らかにした。さらに、Neudesin KOマウスで高脂肪性肥満が抑制される原因として、そのエネルギー消費の増加が関与することを明らかにした。これらの知見はNeudesinのエネルギー代謝、高脂肪食性肥満形成における役割の解明に重要な手がかりを与えるものと期待される。一方、NeudesinがG-protein共役型受容体を介して、そのシグナルを伝えていることを明らかにした。さらに、培養神経芽細胞Neuro2aがNeudeisn受容体を高発現していることを明らかにした。これらの知見は今後のNeudesin受容体解明に重要な手がかりを与えるものと期待される。従って、これまでの研究成果から本研究計画はおおむね順調に進展していると判断している
Strategy for Future Research Activity	1. 高脂肪食で飼育したNeudesin遺伝子欠損の解析によるNeudesinのエネルギー代謝調節における役割の解明 25年度の研究計画の実験内容を引き続き進める。平成26年度以降の新たな研究計画は下記の通り1)高脂肪食以外での様々な飼育環境下（絶食、ケトン食、交感神経刺激等）でのNeudesin遺伝子欠損マウスを解析しNeudesinの役割を詳細に検討する。 2. Nuedesin受容体の同定とそのシグナル伝達機構を解明 Neudesinは分泌性タンパク質であり、標的細胞表面に存在するNeudesin受容体を介して作用すると期待される。従って、Neudesin受容体を同定する。 1) His-tagで標識した Neudesin組換えタンパク質を培養神経前駆細胞あるいは培養前駆脂肪細胞に作用させる。その後、架橋化試薬を加え、このリガンド-受容体間を共有結合させる。細胞膜タンパクを回収する。His-tagを利用したアフィニティークロマト法によりNeudesin-受容体タンパク質の精製を行う。2) 精製されたNeudesin-受容体タンパク質をプロテアーゼ消化によりペプチド断片化する。得られたペプチド断片をLC/ MSによる質量分析法等により、そのアミノ酸配列を決定する。3) 得られた部分アミノ酸配列を指標にして、DNAデータベース、タンパク質データベースを検索して、受容体タンパク質を同定する。4) 受容体タンパク質が同定されれば、受容体が関与する可能性のある様々な細胞内シグナル経路の関与を検討する。5) DNAデータベース検索により、Neudesin受容体遺伝子を同定する。また、cDNAライブラリーからNeudesin受容体cDNAを単離する。さらに、培養細胞にNeudesin 受容体cDNAを導入し、Neudesin受容体高発現細胞系を確立する。6) Neudesin受容体高発現細胞系を用いて、Neudeisn細胞内情報伝達系とその制御メカニズムを解明する。