2014 Fiscal Year Research-status Report
EXiLE法と質量分析法とを用いたアレルゲンエピトープの網羅的解析技術の開発
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25460082
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
中村 亮介 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (50333357)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 里香 国立医薬品食品衛生研究所, その他部局等, 研究員 (40643333) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | アレルゲン / EXiLE法 / 質量分析法 / IgE / ルシフェラーゼ / エピトープ / 抗原抗体反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が開発したIgE crosslinking-induced luciferase expression（EXiLE）法は、ラット培養マスト細胞株に、ヒトの高親和性IgE受容体（FcεRI）遺伝子、および、転写因子NF-AT依存的ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入した細胞株、RS-ATL8細胞を用いる新しいアレルギー試験法である。この細胞はヒトのFcεRIのほか、内在性のラットFcεRIを発現することから、FcεRI架橋を誘導できるとされるマウス抗卵白アルブミン（OVA）-IgEモノクローナル抗体（E-C1）と、誘導できないとされる抗OVA-IgE抗体（E-G5）によりこの細胞を感作し、液相中および固相化した加熱処理OVA抗原へのEXiLE応答を定量的に評価したところ、E-C1抗体は溶液中のOVAに強く応答し、加熱処理OVAにはさらに強く応答することが分かった。一方、E-G5抗体は溶液中のOVAには全く応答しなかったが、これを固相化すると応答が見られるようになった。この結果は、E-G5抗体のOVAとの親和性が低いために溶液中のOVAではFcεRIを架橋できず、avidityの高まった固相化抗原でのみ応答が認められたものと推察された。そこでE-C1抗体とE-G5抗体のOVAとの結合性を表面プラズモン共鳴を用いて測定したところ、予想とは異なり、両者にはほとんど違いがないことが明らかになった。そこで、非還元下のSDS-PAGEによりOVAを分離し、両抗体によるウェスタンブロッティングを行なったところ、E-C1は加熱変性した凝固体を含むすべての分子量のOVAに結合したが、E-G5はほぼ二量体に相当するOVAにのみ結合し、加熱後には結合性が著しく減弱していることが分かった。この結果は、IgEの結合性と架橋活性が全く異なる現象であることを改めて明瞭に示したものと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脱顆粒誘導活性の異なる２種のIgEの反応性の違いを、本研究によって開発した新しい技術によって明瞭に区別することができた。また、これらの反応性の違いが親和性（affinity）の違いによるものであるかどうかを物理化学的に解析した。さらに、それらの結果とウェスタンブロッティングの結果とを総合し、両抗体のエピトープの物理化学的特性を概ね明らかにすることができた。これらの結果を通じ、IgEと抗原との結合性と架橋誘導能の違いを区別することの重要性を示すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに、当初予定していた固相EXiLE法を手法的に確立することにほぼ成功した。この手法は、貴重な患者血清を節約して超高感度アレルゲン測定ができるだけでなく、抗原側の物理化学的変化をマスト細胞の応答性という生理学的なエンドポイントによって再現性高く評価できる画期的な技術となるであろうことが期待される。最終年度に当たる来年度は、人工合成ペプチド等を用いて、実際にこの手法がアレルゲンのエピトープ同定に利用できるかどうかを評価する。
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| Causes of Carryover |
培養細胞株そのものや実験のプロトコルを改良し、アレルギー試験法としての利用法を確立するため、当初の研究計画より多くの条件検討が必要になり、研究補助員を短期採用してこれに取り組むこととしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2015年４月に１名の研究補助員を採用し、培養細胞を用いたアレルギー試験法の改良と利用法の確立に関する研究業務の補助に当たらせる。
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[Journal Article] IKZF1, a new susceptibility gene for cold medicine-related Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis with severe mucosal involvement2015
Author(s)
Ueta M, Sawai H, Sotozono C, Hitomi Y, Kaniwa N, Kim MK, Seo KY, Yoon KC, Joo CK, Kannabiran C, Wakamatsu TH, Sangwan V, Rathi V, Basu S, Ozeki T, Mushiroda T, Sugiyama E, Maekawa K, Nakamura R, Aihara M, Matsunaga K, Sekine A, Pereira Gomes JÁ, Hamuro J, Saito Y, Kubo M, Kinoshita S, Tokunaga K
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Journal Title
J Allergy Clin Immunol
Volume: S0091-6749(14)
Pages: 03744-0
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Genetic variants associated with phenytoin-related severe cutaneous adverse reactions2014
Author(s)
Chung WH, Chang WC, Lee YS, Wu YY, Yang CH, Ho HC, Chen MJ, Lin JY, Hui RC, Ho JC, Wu WM, Chen TJ, Wu T, Wu YR, Hsih MS, Tu PH, Chang CN, Hsu CN, Wu TL, Choon SE, Hsu CK, Chen DY, Liu CS, Lin CY, Kaniwa N, Saito Y, Takahashi Y, Nakamura R, et al.
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Journal Title
JAMA
Volume: 312
Pages: 525-534
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Independent strong association of HLA-A*02:06 and HLA-B*44:03 with cold medicine-related Stevens-Johnson syndrome with severe mucosal involvement2014
Author(s)
Ueta M, Kaniwa N, Sotozono C, Tokunaga K, Saito Y, Sawai H, Miyadera H, Sugiyama E, Maekawa K, Nakamura R, Nagato M, Aihara M, Matsunaga K, Takahashi Y, Furuya H, Muramatsu M, Ikezawa Z, Kinoshita S
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 4
Pages: 4862
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Anaphylactic transfusion reaction in homozygous haptoglobin deficiency detected by CD203c expression on basophils2014
Author(s)
Iwamoto S, Yonekawa T, Azuma E, Fujisawa T, Nagao M, Shimada E, Nakamura R, Teshima R, Ohishi K, Toyoda H, Komada Y
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Journal Title
Pediatr Blood Cancer
Volume: 61
Pages: 1160-1161
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Use of Humanised Rat Basophilic Leukaemia Cell Line RS-ATL8 for the Assessment of Allergenicity of Schistosoma mansoni Proteins2014
Author(s)
Wan D, Ludolf F, Alanine DG, Stretton O, Ali Ali E, Al-Barwary N, Wang X, Doenhoff MJ, Mari A, Fitzsimmons CM, Dunne DW, Nakamura R, Oliveira GC, Alcocer MJ, Falcone FH
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Journal Title
PLoS Negl Trop Dis
Volume: 8
Pages: e3124
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] 「風邪薬」による重症眼粘膜障害を伴うスティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症発症に関連するHLAについて2014
Author(s)
中村亮介, 鹿庭なほ子, 上田真由美, 外園千恵, 杉山永見子, 前川京子, 内田好海, 矢上晶子, 松倉節子, 池澤善郎, 松永佳世子, 徳永勝士, 相原道子, 木下 茂, 斎藤嘉朗
Organizer
第21回日本免疫毒性学会学術年会
Place of Presentation
徳島
Year and Date
2014-09-11 – 2014-09-12
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[Presentation] 日本人のスティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症患者における重症眼粘膜障害発症に関連する医薬品の傾向2014
Author(s)
内田好海, 鹿庭なほ子, 上田真由美, 中村亮介, 杉山永見子, 高橋幸利, 古谷博和, 矢上晶子, 松倉節子, 池澤善郎, 松永佳世子, 外園千恵, 相原道子, 木下 茂, 斎藤嘉朗
Organizer
第21回日本免疫毒性学会学術年会
Place of Presentation
徳島
Year and Date
2014-09-11 – 2014-09-12
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[Presentation] HLA association with antipyretic analgesics-induced Stevens-Johnson syndrome / toxic epidermal necrolysis with severe ocular surface complications in Japanese patients2014
Author(s)
Nakamura R, Kaniwa N, Ueta M, Sotozono C, Sugiyama E, Maekawa K, Yagami A, Matsukura S, Ikezawa Z, Matsunaga K, Tokunaga K, Aihara M, Kinoshita S Saito Y
Organizer
Drug Hypersensitivity Meeting 2014
Place of Presentation
ベルン（スイス）
Year and Date
2014-04-09 – 2014-04-12
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[Presentation] Medication tendencies for inducing severe ocular surface symptoms in Japanese Stevens-Johnson syndrome / toxic epidermal necrolysis patients2014
Author(s)
Kaniwa N, Ueta M, Nakamura R, Sugiyama E, Maekawa K, Takahashi Y, Furuya H, Yagami A, Matsukura S, Ikezawa Z, Matsunaga K, Sotozono C, Aihara M, Kinoshita S, Yoshiro S
Organizer
Drug Hypersensitivity Meeting 2014
Place of Presentation
ベルン（スイス）
Year and Date
2014-04-09 – 2014-04-12
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