2013 Fiscal Year Research-status Report

CERTとVAPの相互作用制御に関する研究　～もたらす因子、もたらされる結果～

Research Project

Project/Area Number	25460086
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	熊谷圭悟国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (40443105)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords	脂質輸送 / セラミド / リン酸化 / FFATモチーフ / メンブレンコンタクトサイト
Research Abstract	平成２５年度中に、これまでの研究成果をJ. Biol. Chem. に発表した。この論文は平成２３年・２４年に日本学術振興会より研究費の交付を受けた研究課題「課題番号 23790118：CERTとVAPの相互作用を制御するメカニズムの解明」の成果の一部と、本研究課題「課題番号 25460086：CERTとVAPの相互作用に関する研究　～もたらす因子、もたらされる結果～」の成果の一部をまとめたものである。　論文の中で、我々はCERTとVAPの相互作用を調節する二カ所のリン酸化部位、すなわち、SRモチーフとS315の関係性について明らかにした。　特筆すべきは、CERTのSRモチーフが疑似リン酸化されたCERT 10Eではセラミド輸送活性が抑制されるが、CERT 10Eに更にS315E変異を導入したCERT 10E/315Eでは、セラミド輸送活性が野生型以上に回復することが見出されたことである。　この現象を利用すれば、CERTのノックアウト細胞にCERT 10Eを安定的に発現させた細胞を準備し、この細胞に対してexpression libraryを発現させれば、S315をリン酸化する因子の発現によってスフィンゴミエリンの生合成を回復させることが可能であるかもしれない。　論文をまとめる過程で着想されたこの新しいスクリーニング法は、申請書に記述されたスクリーニング法と比べて著しく簡便かつ迅速に目的を達成できるものと予想される。　現在、申請書に記述されたスクリーニング法に代わり、上述スクリーニング法の実現可能性について検証している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成２５年度中に研究成果を論文としてまとめたが、その執筆とリバイス対応に想定以上の時間と労力を必要とした。　一方、論文をまとめる過程で新しいスクリーニング法を着想するに至った。　新しいスクリーニング法は、申請書に記述した方法よりも簡便かつ迅速であろうと判断され、現在、その実現可能性の検討を行っている。　こうした動きは申請書のロードマップからは外れるために達成度の評価が難しい所ではあるが、実現した際の進捗は著しいものがあると見込まれる。　クラミジア由来のキナーゼに関しては、実験的なトラブルが発生したために予定通りには進捗していない。　以上を以て、現在の状況はやや遅れていると評価する。
Strategy for Future Research Activity	速やかに、新しいスクリーニング法の実現可能性について検討し、平成２６年度の中頃までに結論を得る。　CKIγ2発現細胞におけるスフィンゴミエリン生合成の低下が、CERT S315Eの発現によってレスキューされることが確認されれば、新しいスクリーニングは実現可能であろう。　新しいスクリーニング法の実現可能性が低い場合は、速やかに申請書に記述された方法に戻り、キナーゼ同定のためのスクリーニングを行う。　二つのスクリーニングを平行して行うことは、マンパワーの不足した現在の状況では効率が悪くなるので行わない。　むしろ、スクリーニングとは重複する部分の少ないクラミジアのキナーゼに関する研究を平行して進める。　平成２６年度末までに、対象としているキナーゼのクローニングを行い、培養細胞、若しくはリコンビナントタンパク質を用いて、性状解析を行うことを目標とする。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	平成２５年度中に申請書の内容でスクリーニングの準備を進めていたが、新たに得られた情報に基づいて、より簡便で迅速に目的を達成できるスクリーニング方法が考案された。　この簡便かつ迅速なスクリーニング方法の実現可能性を先に検討するべきと判断し、検討している。　こうした状況により支出額に変更が生じた結果、当初の予定よりも支出額が少なくなった。今年度は、新たなスクリーニング方法が実現可能かどうか結論を出し、可能であればこれを推進する。　新たなスクリーニング方法を推進するための費用に加え、候補因子の解析を先取りして行うために、大きな支出が見込まれる。　支出の大半は試薬類の購入が占めるため、物品費が中心となる。　新たなスクリーニング方法が困難であった場合には、申請書に記載した内容に沿って計画を進める。