2014 Fiscal Year Research-status Report
腸管マクロファージに発現するNOX1の機能および消化管炎症の病態との関連の解明
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25460110
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| Research Institution | Kyoto Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
加藤 伸一 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (90281500)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩田 和実 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60305571)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | NOX1 / 腸管マクロファージ / 消化管炎症 / サイトカイン / ケモカイン / 活性酸素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸管マクロファージに発現するNOX1の機能および消化管炎症の病態との関連を明らかにする目的で種々の検討を行い、平成26年度は以下のような結果を得た。
1) TNBS直腸内投与は各種炎症性メディエーター発現および活性酸素（ROS）産生の著明な増大を誘起し、さらに細胞内シグナル伝達系では特にNF-κBの活性を誘起した。NOX1遺伝子欠損（NOX1KO）マウスでは野性型（WT）マウスに比較して、炎症性メディエーター発現およびROS産生の増大、NF-κB活性化がいずれも有意に抑制された。以上より、TNBS誘起大腸炎の病態にNOX1/ROSによるNF-κBの活性化が関与していることが判明した。
2) 以前、我々は抗がん剤誘起腸炎の病態にNOX1/ROSによるサイトカイン産生に伴う腸腺窩のアポトーシスが関与していることを報告した。本年度の研究では、柴苓湯がサイトカイン発現阻害作用を示し、その結果アポトーシス誘導を抑制することを明らかにした。柴苓湯によるサイトカイン発現およびアポトーシス誘導阻害にNOX1/ROSの抑制が関与している可能性が推察される（Kato et al., 2015）。
3) 致死線量のX線を照射したWTまたはNOX1KOマウスにWTマウスの骨髄を移植することにより骨髄キメラマウスを作製し、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘起大腸炎の程度を比較検討した。DSS誘起大腸炎の程度を単純にWTとNOX1KOマウスで比較したところ、両マウスの間に何ら差は認められなかったが、骨髄細胞以外のNOX1KOマウスでは、DSS誘起大腸炎は有意に増悪した。前年度の結果を合わせて考えると、骨髄由来細胞（マクロファージなど）とそれ以外（上皮や神経など）に発現するNOX1は、大腸炎の病態において相反する役割を担っており、前者は炎症惹起に、後者は炎症抑制に寄与している可能性が推察される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、本年度は大腸炎の病態に関与する各種炎症性メディエーター発現における細胞内シグナル伝達系について検討し、NF-κBの関与を明らかにすることができた。以前の検討でNOX1/ROSの関与が明らかになっていた抗がん剤誘起腸炎におけるサイトカイン発現増大およびアポトーシス誘導に対して柴苓湯が抑制作用を発揮することを見出した。
NOX1KO骨髄キメラマウスを用いた実験系も予定通り確立し、EGFPで標識したドナーマウスの骨髄を移植することで、レシピエントマウスの骨髄由来細胞がほぼドナーマウスのものでほぼ完全に置換されていることを確認した。当初は、TNBS誘起大腸炎モデルで検討を行う予定であったが、骨髄キメラマウスでは致死線量のX線照射のため、骨髄だけでなく大腸上皮を傷害を受けている可能性があり、上皮を直接エタノールで傷害することでハプテンを作用させるTNBS大腸炎モデルは、正常のマウスよりも傷害が著しく悪化してしまい、正しい評価を行うことができないことが判明した。そのため、DSS誘起大腸炎モデルに切り替えて検討を行い、骨髄由来細胞以外のNOX1KOにより大腸炎が悪化することを認め、おそらく上皮や神経性のNOX1が大腸炎の病態において保護的に作用している可能性が推察された。
当初、RAW264.7細胞においてNOX1のsiRNAを行う予定であったが、最終的に十分なRNA干渉効果を得ることはできなかった。しかし、WTおよびNOX1KOマウスの腹腔マクロファージで検討を行うことで、同様な実験結果を得ることができた。
以上より、平成26年度（2年目）の検討はおおむね順調に進んでおり、次年度（最終年度）の検討を引き続き行っていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
消化管炎症の病態における腸管マクロファージおよび大腸上皮のそれぞれに発現するNOX1の役割を明らかにするため、平成27年度（最終年度）は、骨髄キメラマウスを用いてDSS誘起大腸炎モデルにおける病態解析、さらには腹腔マクロファージおよび大腸上皮細胞株であるYAMC細胞を用いた分子メカニズムの解析を中心に検討を行う。
骨髄由来細胞およびそれ以外のNOX1KO骨髄キメラマウスをそれぞれ作製し、DSS誘起大腸炎の程度を比較するとともに、サイトカイン発現やROS産生、NF-κBの活性化などについても検討する。
腹腔マクロファージを用いた検討では、NOX1の関与について、ROS産生およびNF-κB活性化などについて検討する。
当初は予定されていなかったが、上皮細胞に発現するNOX1が傷害に対して保護的に作用している可能性が明らかになったことから、新たに大腸上皮細胞株であるYAMC細胞を導入し、種々の検討を行う。既に申請者はYAMC細胞においてもNOX1が発現していることを確認している。この細胞株を用いて、上皮細胞に発現するNOX1の役割について、各種サイトカイン発現、ROS産生、およびそれらに関与する細胞内シグナル伝達系について解析する。また、損傷修復、上皮の透過性あるいは抵抗における役割について、NOX1のsiRNAによる影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
当初、RAW264.7細胞のRNA干渉実験を予定していたが、十分な効果が得られなかったため、WTおよびNOX1KOマウスの腹腔マクロファージを使用することとし、次年度にYAMC細胞のRNA干渉実験を実施予定。また、骨髄キメラマウスを用いた検討では、致死線量のX線照射のみでTNBS誘起大腸炎の発生に影響を及ぼしてしまったため、DSS誘起大腸炎モデルでの切り替えたため、一部の実験を次年度に実施することとなった。以上のような理由により、一部の助成金を次年度に持ち越しとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、1) 骨髄キメラマウスを用いたDSS誘起大腸炎の検討、2) YAMC細胞におけるNOX1 RNA干渉実験、3) 腹腔マクロファージレベルでの細胞内シグナル伝達系の関与などについて検討する予定で、実験動物購入費および飼育経費、RNA干渉実験用試薬・器具、細胞培養関連試薬・器具、その他試薬および器具等の消耗品費として使用する予定である。
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[Journal Article] Saireito (TJ-114), a Japanese traditional herbal medicine, reduces 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice by inhibiting cytokine-mediated apoptosis in intestinal crypt cells.2015
Author(s)
Kato S, Hayashi, S, Kitahara Y, Nagasawa K, Aono H, Shibata J, Utsumi D, Amagase K, Kadowaki M
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Journal Title
Plos One
Volume: 10
Pages: e0116213
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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