2013 Fiscal Year Research-status Report
免疫疾患、癌治療標的分子としての酸感受性カリウムチャネルの制御機構解明
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25460111
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyoto Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
大矢 進 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (70275147)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 正徳 京都薬科大学, 薬学部, 助教 (40434667)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | pH感受性カリウムチャネル / 炎症性腸疾患 / 機能制御分子 / リンパ球 / Ｋ２Ｐ５．１ |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、免疫シナプス形成やがん悪性化により誘導されるpH感受性カリウムチャネルK2P5.1と相互作用分子との機能的複合体形成の分子機構・病態的意義を明らかにし、免疫疾患の発症・進展やがん悪性化（浸潤・転移）を予防、治療するための新規創薬シーズを探索することである。平成25年度の研究計画は、炎症性腸疾患モデルのTリンパ球におけるK2P5.1の病態生理学的意義を明らかにするとともに、相互作用分子CD81の相互作用部位の同定とその意義を明らかにすることである。
デキストラン硫酸ナトリウム誘発性炎症性腸疾患（IBD) モデル（急性）から単離した脾臓由来CD4陽性細胞において、pH感受性カリウムチャネルK2P5.1発現が亢進しており、チャネル活性が上昇していることを見出した。また、IBDの慢性化とCD4陽性細胞におけるK2P5.1発現・活性との間に正の相関性が有る可能性を示した。さらに、K2P5.1の新規選択的スプライシング体をクローニングし、これが完全長K2P5.1の細胞膜移行を阻害することによりチャネル活性を抑制し、最終的に細胞内カルシウム流入を阻害することを見出した（次年度の研究計画を一部前倒しして実施した。）。一方、共焦点レーザー顕微鏡によるK2P5.1とCD81の相互作用部位を同定するために必要な実験ツール（蛍光発現ベクターの作成、K2P5.1ノックアウトマウス・CD81ノックアウトマウスの導入）を準備することはできたが、相互作用部位の同定を完了するには至らなかった。次年度実施予定の癌細胞の抗がん剤耐性、ホルモン抵抗性獲得に関わるイオンチャネルの網羅的発現解析も実施し、標的イオンチャネルを同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度において、デキストラン硫酸ナトリウム誘発性炎症性腸疾患モデルマウスの脾臓CD4陽性リンパ球の増殖、分化、浸潤にpH感受性カリウムチャネルK2P5.1発現・機能亢進が重要な役割を果たしていることを明らかにした。K2P5.1とその相互作用分子CD81の作用部位の同定・機能的協関の薬理学的解析に関してはツールの準備を完了するに留まり、本質的な実験は次年度に実施することとした。しかし、次年度の研究計画として予定していた①K2P5.1選択的スプライシング体の機能解析、意義解明や②がん悪性化に関連するイオンチャネル候補分子の探索については前倒しして研究に着手し、一部研究成績を得た。「研究がやや遅れている。」課題と「当初の計画以上に進展している。」課題があり、全体としては「おおむね順調に進展している。」と思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
炎症性腸疾患のTリンパ球におけるpH感受性カリウムチャネルK2P5.1の病態生理学的意義については、急性モデル、慢性モデルの比較、性差について検討する予定である。また、制御性T細胞におけるカリウムチャネルの役割について検討する。制御性T細胞の活性化、IL-10産生増加を助長するカリウムチャネル作用薬の探索も視野に入れる。平成25年度未実施のK2P5.1と相互作用タンパクのイメージング解析については、平成26年度に実施する（実験ツールは既に作成済。）。
平成26年度実施予定のがん細胞のアポトーシス耐性、抗がん剤耐性獲得におけるpH感受性カリウムチャネルの役割解明と局在化の意義解明については予定通り実施する。siRNA導入実験により、標的遺伝子をノックダウンしたときのがん細胞の増殖能、遊走能への影響についても検討する。
K2P5.1選択的スプライシング体の発現機構とその意義の解明については、K2P5.1が比較的高発現するヒト白血病細胞株（K562, THP-1等）を用いて検討する。低浸透圧刺激、低酸素刺激、酸化ストレスを負荷した際のK2P5.1選択的スプライシング体の発現変動、K2P5.1活性変動を解析し、細胞増殖能、細胞周期調節への影響を明らかにする。K2P5.1選択的スプライシング促進機構の解明、促進剤の探索を目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
備品としてパッチクランプ用アンプを購入予定（1,050,000円）であったが、アンプ以外の装置を購入する資金を手に入れることができなかったため、平成25年度には電極作成装置（マイクロフォージ及びプーラー）（546,000円）を購入し、他研究室のパッチクランプ装置を借りて実験を行うこととした。そのため、45万円程度の差額が生じた。
差額分については、電気刺激装置などのパッチクランプ装置関連備品の購入費に充填し、平成26年度に使用する予定である。
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[Journal Article] Up-regulation of KCa3.1 K+ channel in mesenteric lymph node CD4+ T-lymphocytes from a mouse model of dextran sodium sulfate-induced inflammatory bowel disease2014
Author(s)
Ohya S, Fukuyo Y, Kito H, Shibaoka R, Matsui M, Niguma H, Maeda Y, Yamamura H, Fujii M, Kimura K, Imaizumi Y.
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Journal Title
American Journal of Physiology Gastrointestinal Liver Physiology
Volume: 306
Pages: 未定
DOI
Peer Reviewed
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