2013 Fiscal Year Research-status Report
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25460137
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
山口 洋子 日本大学, 歯学部, 助教 (00239922)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大島 光宏 奥羽大学, 薬学部, 教授 (30194145)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 3次元培養 / 口腔がん浸潤モデル / 浸潤阻害剤 |
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| Research Abstract |
がんによる死亡は、浸潤・転移によるものが約９割を占めるということから、安全かつ有効な浸潤阻害薬が求められている。口腔癌もその例外ではなく、浸潤・転移が起こり、その好発部位は肺であることがわかっている。申請者らは予備実験として、生体外がん浸潤モデルを用い、安全性が確立されている生薬の浸潤阻害効果を調べたところ、ある種の生薬に顕著な阻害効果があることを見出した。そこで、入手可能な生薬すべてを用いてスクリーニングを行い、癌細胞の浸潤を阻害する生薬をリストアップし、その作用機序を分子レベルで解明し、最終的には口腔癌細胞の浸潤を阻害する生薬のライブラリーを構築することを目的とした。将来的には、他のがんにもこの手法が応用できると考えている。
本年度は、口腔がんの研究によく用いられている口腔扁平上皮がん（Ca9-22）および舌がん（HSC-3）の株細胞を用いて、3次元培養法により、がん細胞の違いによる浸潤に差があるかを検討した。
3次元培養ゲル中に播種するアグレッシブ線維芽細胞を数種類試し、がん細胞を高度に浸潤させるアグレッシブ線維芽細胞を見い出せたことにより、「口腔がん浸潤モデル」が確立できた。このモデルを用い、熱水またはメタノール抽出の生薬延べ60種類をゲルに作用させ、浸潤阻害作用を検討した。スクリーニングの結果、扁平上皮がんおよび舌がんの両方に浸潤抑制効果が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
3次元培養法を用い、複数の口腔がん細胞株と複数のアグレッシブ線維芽細胞の組み合わせでスクリーニングし、口腔がん浸潤モデル作製のための有効な組み合わせを見いだすことができた。
このモデルを用い、連携研究者の鳥居塚が現在所有する、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ブクリョウ、ボウフウ、リュウタン、ウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミシ、サイコ、サンシシ、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツまたはシンイの33種類の生薬を用いる。それぞれの生薬から、熱水またはメタノール抽出を行い、凍結乾燥した成分を生薬のサンプルとして、口腔がん浸潤阻害効果のある生薬をリストアップした。
その浸潤阻害効果のあった生薬を作用させた3次元培養ゲルからmRNAを抽出し、GeneChip（Affymetrix）を用いて遺伝子発現プロファイルの検索を行い、浸潤を抑制する遺伝子の候補をリストアップしたが候補数があまりに膨大であるため、遺伝子の絞り込み方法を検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
GeneChip（Affymetrix）解析のための検体数を増やし、候補遺伝子を絞り込む。また、候補遺伝子絞込みのためのアルゴリズムを構築し、Gene Ontologyごとに分類する。その絞り込み結果を踏まえて候補遺伝子発現レベルをreal-time PCR（Takara）によって定量化する。IPAパスウェイ解析によってネットワークを形成することがわかった関連遺伝子も定量的に解析する。同時にmiRNAの発現変動についてもreal-time PCRで定量化する。また、タンパク発現等も併せて検討していく。
さらに浸潤抑制効果の見られた生薬の共通点を探るため、メタボローム解析を行う予定である。そのためには試料の粗精製が必要であり、最も回収効率の高い分離法を生薬ごとに試験し、分画ごとの活性をモニターしていきたい。
口腔がん細胞浸潤モデルを用いた浸潤阻害薬のスクリーニング方法では、生薬ががん細胞の遊走を抑制したのか、または線維芽細胞由来の遊走促進因子の分泌を抑制したのか、さらには両者に有効だったのかはわからない。そこで、ボイデンチャンバー法やELISA法を用いて、生薬が奏功した細胞を生薬ごとに判別する実験を行う予定である。
これらの機能アッセイの組み合わせには非常に時間がかかると予想されるが、有効な生薬の共通成分とそのターゲットタンパク特定のために、効率の良いアッセイ方法を検討したい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品等購入の際、値引きおよびキャンペーン等により残金が生じた。
25年度に生じた残高は、26年度の消耗品費と併せて、培地および試薬等の消耗品を購入予定。
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