2014 Fiscal Year Research-status Report
未来型トリテルペンの創出、及びトリテルペン高生産系の確立
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25460142
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| Research Institution | Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences |
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Principal Investigator |
渋谷 雅明 新潟薬科大学, 薬学部, 教授 (50170923)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | トリテルペン合成酵素 / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度、シロイヌナズナのゲノムに見いだした15番目のトリテルペン合成酵素(MXO21.12)をクローニングし、フレームシフトの解除、終止コドンの解除を行い、配列上完全型のクローンを得た。得られた全長DNA断片をプラスミドベクターにサブクローニングし、ラノステロール合成酵素欠損酵母株（GIL-77株）を形質転換し、得られたクローンの酵素活性を検討したが、活性を見いだせなかった。
今年度は、前年度に得たMXO21.12に対し、ダイズ由来β－アミリン合成酵素(GMY)とのキメラ酵素の作成、シロイヌナズナ由来マーネラル合成酵素(MFO20.1)とのキメラ酵素の作成、及びその改変酵素の作成を行なった。まず、PCRによりGMYのN末断片(558bp、アミノ酸186個分)と, MXO21.12のC末断片（1731bp、アミノ酸577個分）端に用いたキメラ酵素を作成した。次に、これらをPCRにより連結し、全長に相当するキメラ酵素のcDNAを得、酵母発現ベクターpYES2に導入した。得られたプラスミドを用いて酵母（GIL-77株）を形質転換した。形質転換酵母を培養後、生成物をシリカゲルTLC解析したが、生成物を確認できなかった。次に、同様に、N末から186番目のアミノ酸の位置でMFO20.1（N末側）とMXO21.12（C末側）のキメラ酵素を作成し、酵母（GIL-77株）を用いて生成物を調べた。しかし、生成物を確認することはできなかった。作成したキメラ酵素(MFO20.1+MXO21.12)の配列とMFO20.1の配列を比較すると731番目以降で相同性が喪失していることが判明したので、次に、キメラ酵素(MFO20.1+MXO21.12)の731番目のリジンを欠損させ、相同性が復活したキメラ改変酵素を作成した。しかしながら、このキメラ改変酵素にも酵素活性を検出することができなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定どおりに目的のキメラ酵素を作成、及びその改変酵素の作成ができたので、おおむね順調に進展していると判断した
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| Strategy for Future Research Activity |
シロイヌナズナの他のトリテルペン合成酵素との相同性を検討し、得られたクローンのアミノ酸を部分的に改変し、酵素活性を復活させる。また、ダイズ(Glycine max）のトリテルペン合成酵素についても、不完全型酵素をクローニングし酵素活性を調べる。
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[Journal Article] Recombinant yeast as a functional tool for understanding bitterness and cucurbitacin biosynthesis in watermelon(Citrullus spp.)2015
Author(s)
91)Rachel Davidovich-Rikanati, Lior Shalev, Nadine Baranes, Ayala Meir, Maxim Itkin, Shahar Cohen, Kobi Zimbler, Vitaly Portnoy, Yutaka Ebizuka, Masaaki Shibuya, Yosef Burger, Nurit Katzir, Arthur A. Schaffer, Efraim Lewinsohn1and Ya’akov Tadmor
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Journal Title
Yeast
Volume: 32
Pages: 103-114
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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