2014 Fiscal Year Research-status Report
標的認識機能を兼ね備えたAib含有へリックスペプチドの核酸医薬への応用
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25460161
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| Research Institution | Osaka University of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
和田 俊一 大阪薬科大学, 薬学部, 准教授 (30278593)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Aib / 両親媒性ヘリックスペプチド / 膜透過性ペプチド / 核酸医薬 / siRNA / RNA干渉 / インテグリンレセプター / RGD配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．Aib 含有ヘリックスペプチド‐オリゴヌクレオチド複合体の細胞内取り込み能の検討・・・平成25年度に合成した Aib 含有ヘリックスペプチド-RGD コンジュゲート体による二本鎖オリゴヌクレオチド (siRNA) の細胞内取り込み能力を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。ペプチドと蛍光で標識したsiRNAをバッファー中、モル比1/100の割合で混合し、30分、37℃で加温し、ペプチド‐siRNA複合体を形成させた後、肺がん細胞(A549)に対して2、8、24時間インキュベーションし、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光観察した。その結果、Aib 含有ヘリックスペプチドの20番目の残基の側鎖を介してRGDペプチドをコンジュゲートさせたPI-RGD、及び2、14番目の両方の残基の側鎖を介してRGDペプチドをコンジュゲートさせたPIII-2(RGD)が、顕著なsiRNAの細胞内取り込み能力を有していることが分かった。
２．Aib 含有ヘリックスペプチド‐オリゴヌクレオチド複合体のRNA干渉効果の検討・・・細胞に移行したAib含有ヘリックスペプチド‐2本鎖オリゴヌクレオチド(siRNA)複合体のRNA干渉効果を、ルシフェラーゼ発現A549細胞に対するルシフェラーゼ発現抑制で検証した。ペプチド/siRNA(1microM/10 pM)複合体を24時間、細胞に作用させた後、細胞を溶解し、発現したルシフェラーゼをアッセイキットを用いて定量した。その結果、PI-RGDが最もRNA干渉効果が強く、その活性は既存のトランスフェクション試薬Lupofectamine2000より強い結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
細胞を用いたRNA干渉効果の実験で再現性が取れず、手間取った．このことが，平成２６年度の達成度に影響した．しかし，種々条件を検討するとともに手技の向上をもって，この問題は解決する方向に向かっている．
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| Strategy for Future Research Activity |
上記に記したように平成２５年度に引き続いて、研究計画において達成度がやや遅れていることから，平成２７年度以降は，さらに効率良く研究を推進していく予定である．平成２７年度はまだ実験を行っていない、ペプチド/siRNAの細胞内取り込みメカニズムについて重点的に取り組んでいく予定である．
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| Causes of Carryover |
上記の「現在までの達成度」に記入した通り、RNA干渉効果の実験で手間取ったため、本年度計画していた実験（siRNAの細胞内取り込み量の測定やメカニズム研究）を行うことができなかったため次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、昨年度行えなかったsiRNAの細胞内取り込み量の測定やメカニズム研究をプラスして実験を行う予定なので、本年度の未使用分を物品費（試薬の購入）に充てる予定である。
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