2013 Fiscal Year Research-status Report

GnRHニューロンの脳内移動におけるセマフォリン3Aの役割

Research Project

Project/Area Number	25460253
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	村上志津子順天堂大学, 医学部, 助教 (20255649)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小池正人順天堂大学, 医学部, 准教授 (80347210) 佐々木光穂順天堂大学, 医学部, 助教 (20432536)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	GnRHニューロン / セマフォリン3A / ニューロピリン１ / ニューロン移動 / ニワトリ胚 / エレクトロポレーション
Research Abstract	生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)産生ニューロンは脳外から脳内へ移動し視床下部に定着する。本研究は、脳内におけるGnRHニューロンの進路変更が反発性軸索ガイダンス分子セマフォリン3A（Sema3A）により制御されている可能性について、ニワトリ胚を用いて実験的に検証することを目指している。組織培養によるニューロン移動アッセイでは、GnRHニューロンの移動能はSema3Aによって抑制され、受容体ニューロピリン１（NP1）抗体投与により抑制が解除されている。生体内でもSema3AがGnRHニューロンに対して同様の反発活性を示すかどうかを知るために、リコンビナントヒトSema3A 浸漬デキストランビーズの前脳内側部への移植を試みた。孵卵3.5日胚（E3.5）を用いた脳室内へのビーズ移植は比較的容易であったが、脳実質内への移植はむずかしく、移植方法を検討している段階である。移動中のGnRHニューロンはSema3A受容体であるニューロピリン１（NP1）mRNAを一時的に発現する。移動過程においてGnRHニューロン上のNP1発現パターンに違いがある可能性を考え、脳内移動が盛んなE6-7にてNP1抗体とGnRH抗体との蛍光二重染色を行った。進路変更前では嗅神経内側枝に沿って移動中の多くのGnRHニューロンはNP1を共発現していたが、移動経路途上あるいは進路変更地点では、嗅神経内側枝から離れたGnRHニューロンはNP1を発現していなかった。この結果は、GnRHニューロンの進路変更にNP1が関与する可能性を強く示唆する。NP1 siRNAを用いてGnRHニューロン上のNP1発現抑制を行うための条件設定を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason １．生体内に異所性にSema3Aを発現させ、GnRHニューロンの移動に及ぼす影響を調べる目的で行ったSema3A浸漬ビーズ移植実験は、技術改善の段階であるため成果は得られていない。E3.5胚の前脳壁がうすく、挿入した直径約80ミクロンビーズは脳実質内に定着しにくいのではないかと考えられる。ニワトリSema3A発現ベクターの供与を得ることができたので、平成26年度はエレクトロポレーション法による前脳へのSema3A遺伝子導入実験を進めていく。２．脳内に侵入したGnRHニューロンは、嗅神経内側枝に沿って進路変更地点である中隔背側部に移動する。免疫組織化学的観察から、GnRHニューロンは嗅神経内側枝に沿った移動ではNP1を発現し、内側枝から離れるとNP1の発現を失う傾向を見いだした。この結果は進路変更においてNP1を介したSema3Aの作用があることを裏付ける証拠となる。当初予定していたNP1 siRNAによるNP1発現抑制実験は抑制効果のあるNP1 siRNAの設計がうまくいかず、実験の進展は滞っている。
Strategy for Future Research Activity	１．GnRHニューロンの進路変更にSema3Aが関与するという仮説は、生体内における実験的検証を必要とする。ニワトリSema3A遺伝子を組み込んだ発現ベクター（福島県立医大・渡邉裕二博士供与）を得ることができたので、エレクトロポレーションにより脳内移動経路上にSema3A遺伝子を異所性に発現させ、GnRHニューロンの動態を調べる。次に、Sema3AのGnRHニューロンに対する作用が受容体を介したものであることを示すために、RNAi法によるGnRHニューロン上のNP1発現抑制実験を進める。移動中のGnRHニューロンが多く存在する嗅神経領域にNP1 siRNAを導入する方法がより効果的と考えている。２．エレクトロポレーションによる嗅板上皮へのNP1 siRNA導入を行う過程で、RNAi法で嗅板上皮のソマトスタチンmRNA発現を抑制したところ、GnRHニューロン移動が抑制される結果を得た。研究代表者はニワトリ胚の嗅覚－前脳系において、GnRHニューロンの移動時期に一致したソマトスタチンの一時的発現を見出している。これらの結果を合わせると、GnRHニューロンの移動過程においてソマトスタチンは促進的に作用している可能性が想定された。マウスでは神経ペプチドのひとつであるコレシストキニン（CCK）がGnRHニューロンの脳内進入を調節している可能性が示されており、GnRHニューロン移動に対するソマトスタチンの促進作用を明らかにすれば、GnRHニューロンの移動メカニズムに関わる因子のひとつを示す重要な知見となる。当初の研究計画を一部変更し、GnRHニューロン移動に対するSema3Aの作用と併せてソマトスタチンの促進作用についても検討する。