2013 Fiscal Year Research-status Report
In vivo胚心筋傷害モデルの作製とマイクロアレーを用いた心筋再生機構の検討
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25460273
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
中島 裕司 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80207795)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 胚心臓 / 心筋傷害 / 心筋修復 / 冠状血管 / 心外膜 / 内皮細胞 / 発生生物学 |
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| Research Abstract |
平成25年度はニワトリ胚心臓心筋傷害モデルの作製を行った。心外膜形成前の発生ステージ16のニワトリ胚心膜体腔を開放し、マイクロビブラトームを用いて右心室前壁の一部を切除、フィブリノーゲン・トロンビンにより切除面をシールし、再孵卵後に生存胚を得ることができた。26年度は、傷害部位、傷害面積の検討を加え、生存率の高いモデルを完成させる。確立した心筋傷害モデルの異なる発生ステージの心臓からパラフィン切片を作製しHematoxylin-Eosin、Picro-Mallory、Masson-Goldner染色を行って、心筋傷害の修復過程を追跡する。また心筋分化マーカーIslet1, Nkx2.5, GATA4, Smooth muscle alpha-actin, Sarcomeric alpha-actinin, Sarcomeric myosin等の免疫染色を行い、修復領域の心筋分化状態について検証する。さらにPhospho-histone H3, PCNA, Ki67, BrdUの免疫染色を行い心筋増殖についても検討する。また心外膜マーカーWT1, Tbx18, Cytokeratin19の免疫染色によって心外膜の修復領域への浸潤について検討する。以上の検討によって心筋修復が最も活発に行われている時期を明らかにし、その領域からmRNAを抽出し、マイクロアレーによって遺伝子発現について網羅的に解析する。
心筋修復に重要な役割を持つ冠状血管内皮細胞の起源についても検討を行った。心外膜原基proepicardial organ を構成する心膜体腔上皮に蛍光標識を行い、その運命を追跡した。その結果WT1陽性のPE表面の中胚葉性上皮から冠状血管内皮細胞が分化することが証明された。26年度は胚心室移植モデルを用いて、蛍光標識した心室内皮細胞が冠状血管内皮細胞に分化するかについて検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
心筋傷害モデルの確立：発生ステージ16の心膜体腔を開放し、マイクロビブラトームを用いて右心室心筋の一部を切除した。出血による死亡を防ぐために心室壁切除面をフィブリン・グル（フィブリノゲン・トロンビン）でシールすることによって6日胚の生存個体を得ることができた。ニワトリ胚心臓の傷害モデルについてはこれまで報告がないので胚心筋の修復・再生過程に関わる成長因子、シグナル伝達、細胞外マトリックス等の分子機構が明らかにできる。26年度はこのモデルを用いて傷害心筋の組織修復過程と分子機構について研究を進めたい。
心臓冠状血管内皮細胞の起源：傷害心筋修復過程ならびに心室心筋発生過程では同時に起こる冠状血管の再生・発生も重要である。しかし現時点では冠状血管内皮細胞の起源については、心外膜原基、静脈洞内皮細胞、心室内皮細胞等の候補があるが不明である。25年度はウズラ心外膜原基表面の上皮組織（心膜体腔上皮）に蛍光色素を標識し、ニワトリ心臓に同所性に移植し、予定運命を追跡した。その結果、冠状血管内皮細胞に標識された細胞が確認され冠状血管内皮細胞の起源の一つとして心外膜原基の表層上皮組織が明らかにされた。また心外膜原基細胞の器官培養モデルを確立し、心外膜原基表面の上皮から管腔を持った血管様構造が形成されることを内皮細胞特異的免疫染色とレーザー顕微鏡を用いた三次元構築によって確認した。26年度は胚心室移植モデルを用いて心室心内膜の関与について検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
心筋傷害モデルを用いた傷害修復過程の検討：確立した心筋傷害モデルから組織切片を作製し、一般染色（Hematoxylin-Eosin、Picro-Mallory、Masson-Goldner）によって修復過程をモニターする。また免疫染色によって、修復過程で発現する心筋幼弱マーカー、分化マーカー、増殖マーカーについて明らかにする (Islet1, Nkx2.5, GATA4, Smooth muscle alpha-actin, Sarcomeric alpha-actinin, Sarcomeric myosin, Phospho-histone H3, PCNA, Ki67, BrdU等)。また心筋修復に対する心外膜の関与については心外膜マーカーの免疫染色によって検討する。以上の検討によって心筋修復が最も活発に行われている時期を明らかにし、その領域からmRNAを抽出、マイクロアレーによって網羅的に遺伝子発現について解析する。
心室心内皮細胞は冠状血管内皮細胞に分化しうるか：確立した心室移植モデルを用いて検討する。ウズラ胚右心室壁内皮細胞を蛍光標識し、ニワトリ胚右心室壁に同所性に移植する。冠状血管が形成されるステージまで発生させ、ウズラ特異的内皮細胞マーカーの免疫染色を行い、移植した心室内皮細胞から冠状血管内皮細胞が形成されているかについて組織切片上で明らかにする。また動脈内皮細胞、静脈内皮細胞特異的マーカーを用いて冠状動脈および静脈内皮細胞の起源についても検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
メーカーから修理不能と判定された回転式ミクロトームを購入予定であったが、修理業者によって修理後、使用可能となったため購入を中止した。また心筋傷害モデルの完成が遅れたため、心筋傷害修復再生過程に起こる遺伝子発現のマイクロアレー解析が実施できなかったためにマイクロアレー外注工作費が執行されなかった。
心筋傷害モデルがほぼ完成したので、傷害修復過程におけるmRNAを抽出し外注工作によってマイクロアレー解析を行う。
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