2014 Fiscal Year Research-status Report
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25460277
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| Research Institution | Koshien University |
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Principal Investigator |
後藤 隆洋 甲子園大学, 栄養学部, 教授 (20135693)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴田 昌宏 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10343253)
小池 正人 順天堂大学, 医学部, 教授 (80347210)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | レスベラトロール / PC12細胞 / LC3mRNAノックダウン / オートファジー / オートファゴソーム / 細胞生存関連タンパク質 / 細胞死関連タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちはレスベラトロール（RSV）が神経系細胞株のPC12細胞で、この細胞が、未分化な状態（腫瘍性）では細胞死を引き起こし、分化した状態（神経性）では細胞生存を促進させることを見出した。RSVの細胞死と細胞生存の相反する作用は、細胞の分化度によりミトコンドリアとオートファジーの活性化の違い、すなわちこれら細胞小器官の機能を、未分化細胞では抑制し細胞死に、分化細胞では促進し細胞生存に関与すると考えている。RSVはカロリー制限様作用をもち、オートファジーはカロリー制限で活性化するので、このオートファジー機能に注目し、PC12細胞でオートファジー遂行遺伝子の１つであるLC3mRNAをノックダウンした細胞（LC3KD細胞）を作製し、RSVの効果をそれぞれの未分化及び分化型細胞で解析した。
前年度に予備的解析を行い、今年度は実質的に解析した。以下コントロール細胞（野生型及びmock細胞）と比較してLC3KD細胞での有意な変化のみを示す。細胞死は未分化、分化細胞共に増加したが、RSV投与で未分化細胞は変化なし、分化細胞では増加した。オートファゴゾームは未分化細胞ではRSV非投与で減少、分化細胞ではRSV投与で減少した。ミトコンドリアはRSV非投与の分化細胞以外すべての場合で減少した。
両LC3KD細胞での細胞生存・細胞死関連タンパク質の発現は以下の通りであった。SIRT1、SOD2、リン酸化Akt及びmTORは増加したが、SIRT3、カテプシンD及びミトコンドリアATP合成酵素は減少した。しかし、リン酸化AMPKは未分化細胞では減少、分化細胞では増加した。これらのタンパク質の発現変化は基本的にRSV非依存的であった。
SIRT1ノックダウン細胞ではLC3の発現に変化がなかったので、RSVのより直接の標的はSIRT1よりLC3の可能性があり、LC3がRSVの正常未分化及び分化PC12細胞の適正な作用（癌細胞は殺し、正常細胞は保護し寿命を延ばす）に本質的であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PC12細胞でLC3mRNA遺伝子をノックダウンしたLC3KD細胞において、それぞれの未分化と分化細胞で、形態学的及び生化学的解析を行い、RSVの両細胞での作用について検討した。細胞死に関してはRSV非投与で両細胞共に細胞死が有意に増加した。RSV投与で未分化細胞は野生型とほぼ同じ傷害効果がみられ変化がみられなかったが、分化細胞では有意に細胞死が増加した。LC3タンパク質の発現が低下するとRSVに対して分化細胞の方が障害的影響を受けやすいことがわかった。
しかし、LC3KD細胞では野生型細胞とは有意に異なるが、未分化と分化型共にオートファジー及びミトコンドリアに関係した細胞生存及び細胞死関連タンパク質の発現変化がほぼ同じであった。さらに重要なことにこれらタンパク質の発現変化は基本的にRSVの影響を受けなかった。これらの結果はRSVのPC12細胞、すなわちその未分化と分化型への異なる作用機序についてLC3タンパク質の発現が必須であることがわかった。またRSVの最初の作用ターゲットは寿命関連遺伝子であるSIRTファミリー、特にSIRT1であると考えられているが、私たちはSIRT1よりLC3の方がより上流にあることをLC3KD細胞とSIRT1ノックダウン細胞の両方の結果から明らかにした。
これらのデータから得られた私たちの所見は今までの見解と異なるため極めて興味深いと考え、これら新規のデータをまとめ国際誌に投稿した。しかし、細胞死の測定法に問題があり現在より改良された測定法を使用することと、癌細胞も含め他の種類の細胞でもLC3タンパク質発現低下で同様の結果になることがよりデータの客観性を増すことになり、現在次の段階の実験の前にこの解析も進めているため、最初の予定よりやや遅れている状況である。しかし、この解析法の習得や多種類の細胞の活用は今後の新規の研究に利用できかつデータの信頼性に有用なので、達成度の遅れはやむを得ない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今までの私たちのRSVの老化促進マウス及び培養細胞（PC12細胞）への作用から推測して、RSVは細胞レベルでは分化・寿命の促進効果がみられたが、個体レベルでの寿命延長効果は認められなかった。
今後は、達成度の項目で記載した研究も継続しながら、RSVの動物及び細胞への作用効果の解析と並行して、予備的解析で細胞及び個体レベルで寿命延長効果が確認されている他のファイトケミカル、すなわち冬虫夏草と冬虫夏草だけに存在する構成物質であるコルジセピン（cordycepin、分子量251、核酸系の物質でDNA及びRNAの合成を競合的に阻害し、癌細胞を殺す作用をもつ）の検討を行う。コルジセピンはRSVとの類似作用もあると予想しており、RSVの作用機序と比較して、細胞及び個体の寿命延長作用が存在するか、存在すれば寿命関連SIRTファミリー遺伝子／タンパク質の発現変化に加え、オートファジー（オートファゴソーム）やミトコンドリアの活性化との関係について解析する。
現在、冬虫夏草をすでに食塩感受性高血圧ラット（ダールラット）に投与し、有意の寿命の延長効果を確認しており（寿命解析については継続中）、このラットの循環器関連組織・細胞の形態学的生化学的変化を解析する予定である。すなわち、冬虫夏草及びコルジセピンの癌抑制作用に加え（脂肪細胞に対して分化抑制作用があり、肥満関連疾患に有効の指摘もある）、他の有効な新規の作用を上記の２種類の細胞小器官を中心に疾患モデル動物及び種々の細胞株を用いて分子・細胞レベルで明らかにし、真に正常の動物延いてはヒトの健康寿命の延長に寄与する機能性食品成分見つけることを目指す。
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| Causes of Carryover |
達成度の項目で記載したように作成した論文内容の解析方法で投稿時の査読の段階で問題が生じた。その問題解決のため、次年度で予定より多くの研究費が必要となったため、平成26年度分の使用分をできるだけ抑えることにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞死測定キット（蛍光発色で細胞死の検出が可能）を購入してファイトケミカルによる細胞死をPC12細胞に加えて他の細胞株を購入あるいは共同研究者に依頼しそれらの細胞も含め解析する。この細胞死測定法と多種類の細胞を使用することにより、レスベラトロール、冬虫夏草、コルジセピンの細胞死あるいは細胞生存の効果をより客観的に解析する。
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