2014 Fiscal Year Research-status Report
２波長イメージングによる全心臓のカルシウム動態とエネルギー消費の同時計測法の開発
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25460283
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
小畑 孝二 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40378229)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高木 都 奈良県立医科大学, 医学部, 特任教授 (00033358)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | カルシウムイメージング / 心筋細胞 / エネルギー代謝 / 収縮性 / 酸素消費 / G-CaMP / 総機械的エネルギー / カルシウムトランジェント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、遺伝子コード型蛍光カルシウムプローブ（genetically encoding calcium indicators；GECIs）の一つであるG-CaMPを用いて丸ごと心臓でのカルシウムイメージングによる細胞内カルシウム動態と心臓一拍毎の心筋酸素消費量と発生する総機械的エネルギーの関係を調べることである。申請者は以前所属していた奈良県立医科大学で科学研究費の助成を受け、ラット血液交叉灌流摘出心臓を用いた実験系で、多くの成果を残してきた。このラット血液交叉灌流摘出心臓の実験系は、左心室圧―容積関係から総機械的エネルギーを求め、同時に冠循環の動静脈血液酸素濃度較差のリアルタイム測定により心筋酸素消費を算出することができる世界で申請者のみが行うことができる他に類を見ない優れた実験系である。本研究ではそれに加え、心筋細胞の収縮性を調節する重要な因子である細胞内カルシウムの変化を同時計測し、それらの関係を明らかにすることを目指す。もし成功すれば、従来考えられていた理論の立証にとどまらず、心臓において圧負荷や容積負荷などのストレス時に、細胞内カルシウム動態とエネルギー代謝の変化を観察することができ、さらには心不全と言った心疾患の病態生理の解明等に活躍が期待できる。すでに改良型G-CaMPとDsRed（赤色蛍光）の2つの遺伝子を同時発現するトランスジェニックラットを作製した。今後、ブレインビジョン社製の高速イメージングシステムを用いて、2波長同時計測システムの構築を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
申請者は、以前所属していた奈良県立医科大学第二生理学講座の時代から科学研究費補助金を受け、岐阜大学医学部生理学教室に異動後も、G-CaMP遺伝子組換えラットを用いて、摘出心臓の血液交叉灌流実験系を用いたカルシウムイメージングと心臓の力学的エネルギー学的性質を調べる同時計測の確立を目指して、一貫して研究を行ってきた。昨年は、改良型G-CaMP-DsRed遺伝子組換えラットの移動時に、微生物モニタリングの結果、クリーン化が必要となり、実験に使用できないトラブルに見舞われた。本年度は、従来使用していた電磁流量計が故障し、製造中止のため超音波血流計を購入した。そのため、種々の条件が変更になり、装置の設定などの調整中である。しかし、遺伝子組換えラットを使用できない時期は、興奮収縮連関の酸素消費を計測することで、間接的ではあるがカルシウムハンドリングのエネルギー消費を見積もることができる方法で、温度変化がもたらす影響について大変興味深い知見を得ており、論文作成中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラットのクリーン化や機器の故障など多くのトラブルに見舞われたため、思うように進んでいないのが現状である。この実験の最終目的は、心臓の収縮性、エネルギー消費、細胞内カルシウム動態の関係を明らかにすることである。そのため、直接的にカルシウム動態を観察する手法、つまりカルシウムイメージングを行う。申請者は遺伝子コード型蛍光カルシウムプローブ（GECIs）の一つである改良型G-CaMP-DsRed遺伝子組換えラットを作製した。しかし、G-CaMPでは細胞内カルシウム濃度の変化を正確に計測できない可能性もある。そこで、申請者もこれまでに使用しており、研究実績の高い蛍光指示薬であるFluo-3等の試薬を用いた丸ごと心臓でカルシウムイメージングについても検討する必要がある。また、興奮収縮連関の酸素消費を計測するという、間接的ではあるがカルシウム動態を調べる方法も考慮する必要がある。つまり、本研究の目的は単に技術の開発だけでなく、なぜ心機能が低下するか、負荷が加わったらどうなるか、その時のエネルギー消費と細胞内カルシウムの関係はどうなっているのかと言った疑問を明らかにすることである。これまで一貫してカルシウムイメージング法の構築を目指してきたが、今後はそれを継続しつつ、多面的なアプローチも積極的に取り入れていく必要があると考えている。
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