2015 Fiscal Year Annual Research Report
新しい抗線維化薬の開発に向けた活性酸素産生酵素NOX4のシグナル伝達機構の解明
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25460339
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
勝山 真人 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60315934)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 活性酸素 / NADPHオキシダーゼ / 線維化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NOX4/NADPHオキシダーゼはTGF-βにより発現が誘導され、NOX4が産生する活性酸素種（ROS）は組織線維化に関与する。また細胞種によっては増殖に関与することが知られている。
NOX4由来ROSの標的蛋白を同定するため、cICAT法と質量分析を用いた網羅的解析を行った。ヒト肺線維芽細胞株をTGF-βで刺激し、NOX4に対するRNA干渉によりNOX4をノックダウンした際にシステインの酸化修飾が減少する蛋白を探索した。同定された13種類の蛋白のうち、特に2つの蛋白に注目した。
細胞外マトリックスの重合に関与すると考えられる蛋白Xは、定量PCRの結果、NOX4のノックダウンによりmRNAレベルで発現量が低下していることがわかった。アクチノマイシンDの添加によってもNOX4のノックダウンによるmRNAレベルの低下は影響を受けなかったことから、NOX4由来ROSが蛋白XのmRNAの安定化に関わる可能性が考えられた。しかしこの結果はNOX4に対するRNA干渉のオフターゲット効果、すなわちNOX4に対するsiRNAが蛋白XのmRNAを直接分解している可能性も考えられ、別のsiRNAを用いたさらなる解析が必要である。
一方機能未知の蛋白Yは定量PCRの結果、NOX4のノックダウンによるmRNAレベルでの発現量の低下は認められなかった。蛋白Yの酸化修飾がNOX4由来ROSに依存するかどうかを確認するため、総蛋白をPEGマレイミドで標識した後泳動し、ウエスタンブロットにより蛋白Yを検出した。するとTGF-βで刺激した際に認められる高分子側へシフトしたバンドが、NOX4のノックダウンにより認められなくなった。同様の結果がDNAマレイミドを用いた検出においても得られたことから、蛋白YがNOX4由来ROSの直接の標的である可能性が高いと考えられた。今後は蛋白YのNOX4由来ROSにより修飾されるシステイン残基を置換した変異体を作製し、線維化における蛋白Yの果たす役割を解析することが必要であると考えている。
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