神経・免疫系による腸管恒常性維持制御機構とその破綻

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460380
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 幡野 雅彦 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20208523)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤村 理紗 千葉大学, バイオメディカル研究センター, 助教 (30376363)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 炎症性腸疾患 / 腸管神経 / 腸内フローラ / 腸管上皮バリア / 遺伝子組換えマウス / nNOS

Research Abstract

腸管神経細胞が増加している遺伝子改変マウス(Ncx KOマウス、Kif26a KOマウス)を用いて腸管上皮細胞の構築、腸内フローラ、腸管免疫についての解析を行った。
(１) Ncx KOマウス腸管神経節においては一酸化窒素(NO)産生ニューロンが増加している。Ncx KOマウスにおいては腸管神経細胞由来のNOが上皮細胞に作用し、β-cateninのSNO化、E-cadherinのジャンクションからの解離をきたし上皮細胞バリア機能が破綻するとの仮説をたてた。この仮説の検証のために以下の実験を行った。（a）Ncx KOマウスの腸管上皮細胞におけるS-nitrosylationについてウエスタンブロットにて解析したところS-nitrosylationされた蛋白が増加していた。（b）nNOS特異的な阻害剤L-NPAをNcx KOマウスに投与しE-cadherinの発現および腸管透過性について解析したところ、L-NPA投与によりE-cadherinの発現は増加した。（c）抗ニトロチロシン抗体によりNcx KOマウスの腸管を免疫染色しNO産生について解析したところ、一部の上皮細胞において濃く染色される細胞が見いだされた。
（３）同じケージ内で飼育しているNcx KOおよび野生型マウスの糞便より経時的にDNAを抽出する。各細菌特異的な16SrRNAのプライマーを用いquantitative real-time PCRを行い腸内細菌フローラについて質的・量的な解析を行ったところKOマウスにおいてはEnterobacteriaceaeの増加、およびBifidobacteriumの減少傾向が認められた。
（４）Ncx KOマウスの腸管免疫系について解析を行い神経由来NOの腸管免疫系制御響について解析をおこなった。Ncx KOマウスおよびKif26a KOマウスともに糞便中のIgAの減少傾向が認められた。
以上の結果よりNcx KOマウス、Kif26a KOマウスともに腸内フローラにおいてdysbiosisが起きていることが示唆され、腸管神経細胞増加にともなうNOによるものであることが推測された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

腸管上皮細胞のバリア機構の低下が腸管神経増加にともなうNOによるものであることが明らかとなった。また、腸管神経細胞増加によりdysbiosisをおこすことも明らかとなった。これらの成果は第42回日本免疫学会において講演発表を行った。

Strategy for Future Research Activity

Ncx KOマウスにおける上皮細胞バリアと神経細胞増加の関連がほぼ明らかとなったが、腸内フローラとの関連についてもより詳細に詰めていく予定である。次世代シークエンサーを用いた腸内細菌層の解析も視野にいれ進めていく予定である。また、免疫系の異常についても今後重点を置いて解析する。
同様の表現系を持つKif26a KOマウス、Nczfヘテロマウスについても解析を進め、腸管神経系と腸管免疫、腸管バリア機構の相互関係について分子レベルで明らかにする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

消耗品の一部が他の経費により購入できたため。
試薬等消耗品の購入に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Plant homeodomain finger protein 11 promotes class switch recombination to IgE in murine activated B cells. (2014)
  • Author(s): Ikari, J., Inamine, A., Yamamoto, T., Watanabe-Takano, H., Yoshida, N., Fujimura, L., Taniguchi, T., Sakamoto, A., Hatano, M., Tatsumi, K., Tokuhisa, T.and Arima, M.
  • Journal Title: Allergy Volume: 69 Pages: 223-230
  • DOI: 10.1111/all.12328
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation of tissue-specific H-2Kd transgenic mice for the study of K(d)-restricted malaria epitope-specific CD8+ T-cell responses in vivo. (2013)
  • Author(s): Huang, J., Li, X., Kohno, K., Hatano, M., Tokuhisa, T., Murray, P.J., Brocker, T. and Tsuji, M.
  • Journal Title: J.Immunol.Methods Volume: 387 Pages: 254-261.
  • DOI: 10.1016/j.jim.2012.10.019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ADAR1 protein induces adenosine-targeted DNA mutations in senescent Bcl6 gene-deficient cells. (2013)
  • Author(s): Tsuruoka, N., Arima, M., Yoshida, N., Okada, S., Sakamoto, A., Hatano, M., Satake, H., Arguni, E., Wang, J.Y., Yang, J.H., Nishikura, K., Sekiya, S., Shozu, M. and Tokuhisa, T.
  • Journal Title: J. Biol. Chem Volume: 288 Pages: 826-836
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.365718
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Integration of the mouse sperm fertilization-related protein equatorin into the acrosome during spermatogenesis as revealed by super-resolution and immunoelectron microscopy. (2013)
  • Author(s): Ito, C., Yamatoya, K., Yoshida, K., Fujimura, L., Hatano, M., Miyado, K. and Toshimori, K.
  • Journal Title: Cell Tissue Res. Volume: 352 Pages: 739-750
  • DOI: 10.1007/s00441013-1650-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Lack of both α2-antiplasmin and plasminogen activator inhibitor type-1 induces high IgE production. (2013)
  • Author(s): Okada, K., Ueshima, S., Kawao, N., Yano, M., Tamura, Y., Tanaka, M., Sakamoto, A., Hatano, M., Arima, M., Miyata, S., Nagai, N., Tokuhisa, T. and Matsuo, O.
  • Journal Title: Life Sci. Volume: 93 Pages: 89-95
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2013.05.023
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The effect of platelet-rich plasma on posterolateral lumbar fusion in a rat model. (2013)
  • Author(s): Kamoda, H., Ohtori, S., Ishikawa, T., Miyagi, M., Arai, G., Suzuki, M., Sakuma, Y., Oikawa, Y., Kubota, G., Orita, S., Eguchi, Y., Yamashita, M., Yamauchi, K., Inoue, G., Hatano, M. and Takahashi, K.
  • Journal Title: J.Bone Joint Surg.Am. Volume: 95 Pages: 1109-1116
  • DOI: 10.2106/JBJS.L.00320
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Kinetics and protective role of autophagy in a mouse cecal ligation and puncture-induced sepsis. (2013)
  • Author(s): Takahashi, W., Watanabe, E., Fujimura, L., Watanabe-Takano, H., Yoshidome, H., Swanson, P.E., Tokuhisa, T., Oda, S. and Hatano, M.
  • Journal Title: Crit. Care Volume: 17 Pages: R160
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Bcl6 regulates production of SLAM-Associated protein in follicular helper T cells (2013)
  • Author(s): Toshibumi Taniguchi, Akemi Sakamoto, Masahiko Hatano, Kenji Matsumoto, Hirohisa Saito, Takeshi Tokuhisa and Masafumi Arima
  • Organizer: 第42回日本免疫学会
  • Place of Presentation: 千葉・幕張メッセ
  • Year and Date: 20131211-20131213
• [Presentation] Possible role of enteric neurons in regulation of intestinal microbiota. (2013)
  • Author(s): Lisa Fujimura, Yukiko Ohara, Masafumi Arima, Akemi Sakamoto, Takeshi Tokuhisa and Masahiko Hatano
  • Organizer: 第42回日本免疫学会
  • Place of Presentation: 千葉・幕張メッセ
  • Year and Date: 20131211-20131213
• [Presentation] 高解像顕微鏡およびSTEDを用いた受精関連タンパク質Equatorinの解析 (2013)
  • Author(s): 伊藤千鶴、大和屋健二、吉田恵一、藤村理紗、幡野雅彦、宮戸健二、年森清隆
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第69回学術講演会
  • Place of Presentation: 大阪・ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 20130520-20130522
• [Presentation] 精子先体赤道部糖タンパク質equqtorinの分子量低下に関わる酵素の探索
  • Author(s): 大和屋健二、伊藤千鶴、陳城、前川眞見子，幡野雅彦、年森清隆
  • Organizer: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 栃木・自治医科大学キャンパス