Defining the KRAS signaling cascade using a genome-edited human bronchial epithelial cell line

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25460395
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: シバスンダラン カルナン 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30557096)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小西 裕之 愛知医科大学, 医学部, 教授 (20344335) ; 細川 好孝 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60229193)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: KRAS / 変異ノックイン / 気管支上皮細胞株

Outline of Annual Research Achievements

以前、研究代表者らは、アデノ随伴ウイルスの骨格を持つターゲッティングベクターを用いて非癌ヒト気管支上皮細胞に由来する不死化細胞株NuLi-1の遺伝子改変を行った。その結果、2本の野生型KRAS遺伝子アレルのうち1本が癌原性の活性化型KRASG12V変異アレルに置換（変異ノックイン）された細胞クローンを樹立した。
本研究ではまず、樹立したKRAS変異ノックインクローンの細胞特性を様々なアッセイによって野生型KRAS遺伝子を持つ対照クローンと比較した。その結果、KRAS変異ノックインクローンの細胞形態は疎な紡錘体様に変化しており、軟寒天培地中でも増殖し足場非依存性コロニーを形成することがわかった。また、ERKタンパク質の恒常的な過剰リン酸化を呈することから、KRASからの増殖シグナルを伝達する下流経路のうちMEK-ERK経路の活性が亢進していることが示唆された。これらの結果から、KRAS遺伝子1アレルへの活性化変異のノックインによってNuLi-1細胞株が一定の癌形質を獲得することが示された。
次に、KRAS変異ノックインクローンと対照クローンのマイクロアレイ解析を行ったところ、KRAS変異の有無によって遺伝子発現プロファイルが明確に2大別された。KRAS変異ノックインクローンでは上皮間葉転換の指標となる遺伝子の発現が亢進し、上皮マーカー遺伝子の発現が低下していた。また、プロテオーム解析を行ったところ、KRAS変異ノックインクローンにおいてコラーゲンおよびコラーゲン合成を制御する酵素タンパク質の発現が亢進していた。KRAS変異によって発現量が増加するこれらの分子の役割を調べるため、CRISPR-Cas9システムに基づく遺伝子ノックアウトを行った。今後、単離したクローンの表現型を解析することによって変異KRASの増殖シグナルを媒介する重要な分子を同定し、創薬標的を探索する方針である。

Research Products

• [Journal Article] Delta40p53 suppresses tumor cell proliferation and induces cellular senescence in hepatocellular carcinoma cells (2017)
  • Author(s): Ota A, Nakao H, Sawada Y, Karnan S, Wahiduzzaman M, Inoue T, Kobayashi Y, Yamamoto T, Ishii N, Ohashi T, Nakade Y, Sato K, Itoh K, Konishi H, Hosokawa Y, Yoneda M
  • Journal Title: J Cell Sci Volume: 130 Pages: 614-625
  • DOI: 10.1242/jcs.190736
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition of Nox1 induces apoptosis by attenuating the AKT signaling pathway in oral squamous cell carcinoma cell lines (2016)
  • Author(s): Ito K, Ota A, Ono T, Nakaoka T, Wahiduzzaman M, Karnan S, Konishi H, Furuhashi A, Hayashi T, Yamada Y, Hosokawa Y, and Kazaoka Y
  • Journal Title: Oncol Rep Volume: 36 Pages: 2991-2998
  • DOI: 10.3892/or.2016.5068
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient AAV-mediated gene targeting using 2A-based promoter-trap system (2016)
  • Author(s): Karnan S, Ota A, Konishi Y, Wahiduzzaman M, Tsuzuki S, Hosokawa Y, and Konishi H
  • Journal Title: Bio-Protoc Volume: 6 Pages: e2058
  • DOI: 10.21769/BioProtoc.2058
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 遺伝子改変・ゲノム編集効率を測定するアッセイ系としてのPIGA遺伝子の利用 (2016)
  • Author(s): 小西裕之, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川・横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] NOX1はAKTシグナルを介して口腔扁平上非癌細胞の生存に寄与する (2016)
  • Author(s): 太田明伸, Sivasundaram Karnan, 小西裕之, 風岡宜暁, 細川好孝
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川・横浜）
  • Year and Date: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [Presentation] 悪性胸膜中皮腫の早期診断の腫瘍マーカーの検討 (2016)
  • Author(s): Sivasundaram Karnan, 太田明伸, Md Wahiduzzaman, 小西裕之, 細川好孝
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城・仙台）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] Combined arsenic trioxide-cisplatin treatment enhances apoptosis in leukemic cell lines (2016)
  • Author(s): Md Wahiduzzaman, Akinobu Ota, Sivasundaram Karnan, Hiroyuki Konishi, Yoshitaka Hosokawa
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城・仙台）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] 肝がん細胞株におけるp53アイソフォームdelta40p53の性状解析 (2016)
  • Author(s): 太田明伸, Md Wahiduzzaman, Sivasundaram Karnan, 小西裕之, 細川好孝
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城・仙台）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] CRISPR-Cas9システムによる変異ノックイン ― プロモータートラップ法の比較検討 (2016)
  • Author(s): 小西裕之, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会第1回大会
  • Place of Presentation: 広島国際会議場（広島・広島）
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-07