2015 Fiscal Year Research-status Report
異環境に棲息する寄生蠕虫ミトコンドリア呼吸鎖のプロテオーム解析
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25460519
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
高宮 信三郎 順天堂大学, 医学部, 講師 (90138206)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤村 務 東北医科薬科大学, 薬学部, 教授 (70245778)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 寄生蠕虫 / 低酸素適応 / 呼吸鎖 / 肺吸虫 / マンソン裂頭条虫 / 回虫 / ミトコンドリア / シトクロムb５ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は下記に示す３項目を立案した。１）ブルーネイテブ（BN）電気泳動によるミトコンドリア(Mit)呼吸鎖複合体の解析（高宮担当）: 肺吸虫成虫、マンソン裂頭条虫（Se）のMit分画をBN電気泳動により解析、活性染色にはその変法のクリアネイテブ（CN）電気泳動を用いる。対照として回虫成虫Mitを用いる。そのため、本年度はSeについてCN電気泳動の活性染色における実験条件の検討を行った。本条虫の亜Mit画分には、好気的Mitとは異なって、コハク酸依存性に過酸化水素を生成することが前年度の研究結果から示唆されていたが、Amplex-HRP系を用いてその生成活性を定量した。その結果、0.272nmol/min/mg の値が得られ、コハク酸依存性の酸素消費活性（2.08nmol/min/mg）の約1/10の活性であった。さらに、Se成虫Mit分画には、NADH依存性の酸素消費と過酸化水素生成が観察された。これらの結果は、CN電気泳動後の活性染色において基質および発色剤を選択するうえで重要な知見である。
２）各発育段階で特異的に発現している蛋白の同定（高宮担当）:現在進行中であり、これまでに回虫成虫Mitの二次元電気泳動ゲルにおいては、全スポット約200個のうち60スポットを単離、インゲル消化を行い質量分析計で消化ペプチドの解析データを得ている。好気的代謝を行う自活性線虫Caenorhabditis elegansのMitについては同様に電気泳動を行い、全約130スポットのうち91スポットの解析がすでに終了して、アノテーション作業も終えている。残り約40スポットを解析中である。また、本虫Mitのプロテオーム解析に必須な、インビトロ大量培養法と餌の大腸菌の汚染がないC. elegans虫体の精製法について、学術誌に投稿し既にアクセプトされている。
３）キノン結合蛋白の検索（藤村担当）:現在進行中であり、回虫から精製したRQが十分量蓄積したので、本標品および市販のUQを共有結合させたaffinity chromatography columnを作製中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
科学研究費助成事業補助事業期間延長申請が認められたことによる一年の期間延長と、当該年度中に実験材料の入手が達成されたこと、および以下に述べる実績を考慮するとほぼ順調に進捗していると言える。 1）については、本年度はウエステルマン肺吸虫およびマンソン裂頭条虫のMitについてブルーネイテブ（BN）電気泳動による解析を予定していた。このうち、マンソン裂頭条虫Mitについては、研究実績の概要で記述したように、クリアネイテブ（CN）電気泳動の活性染色法の至適条件確立のため過酸化水素産生活性を測定し、回虫と比較検討し、重要な知見を得ている。ウエステルマン肺吸虫Mitについても、成虫が入手次第解析する予定である。
2）C. elegans のMitについては、二次元電気泳動の蛋白スポットのうち、70％は解析が終了し、次年度中には残り30％も完了する予定である。また、本虫Mitのプロテオーム解析に必須な、インビトロ大量培養法と餌の大腸菌の汚染がないC. elegans虫体の精製法については学術誌にすでに投稿しアクセプトされている。さらに、回虫成虫に特異的に発現する分泌型のシトクロムb５に関しても、回虫とC. elegansのシトクロムb５ホモログについてインシリコ解析が終了し、学術誌に発表ずみである。3）については、担当者が他大学に移籍したため、現在進行中であるが、affinity chromatography columnのligand として用いるロドキノン(RQ)については当該年度中に回虫生体材料から抽出し精製が完了している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）ブルーネイテブ(BN)およびクリアネイテブ（CN）電気泳動によるミトコンドリア(Mit)呼吸鎖複合体の解析（高宮担当）：活性染色に関する予備的な結果を得ているのでウエステルマン肺吸虫、マンソン裂頭条虫いずれも、成虫虫体が入手次第Mitを調製して実験を遂行する。これらの寄生虫の生化学的研究には虫体のサイズが大きい成虫が必要であるが、成虫を得るには終宿主である実験動物（イヌ、ネコ等）に感染させて一定期間飼育する必要があり、それに費やす経費は研究費の多くを占める。また、実験動物保護の観点からも宿主なしで成虫を得ることが望まれる。これまで終宿主なしで成虫にまで発育させるインビトロ培養は確立されていない。本研究ではメタセルカリアから成虫まで、あるいは、プレロセルコイドから成虫までに発育させる培養法を確立する必要がある。今後の研究の方策として、実験動物から成虫の回収が困難になる場合に備え、成虫までのインビトロ培養法の開発を目指す。肺吸虫については、出発材料であるメタセルカリアの感染率が高いサワガニの棲息地をすでに関東近辺で見いだしている。
２）各発育段階で特異的に発現している蛋白の同定（高宮担当）：自活性線虫Caenorhabditis elegansのMitについては、次年度中には全スポットの解析を終了する予定である。回虫については、残余の未解析のスポットについて解析を進める予定である。
３）精製したロドキノン(RQ)をligandとするaffinity chromatography columnを作製してキノン結合蛋白を検索する。マンソン裂頭条虫プレロセルコイドのキノン分画に見いだされた未知物質の化学的性質を明らかにする予定である(藤村、高宮担当）。
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| Causes of Carryover |
既に承認された補助事業期間延長承認の申請書に記述したように、「寄生虫学研究：材料と方法」の編集業務に携わったこと、また、実験材料の入手が困難になったことにより、当初計画した実験を延期せざるを得なかったため。さらに分担研究者が他大学へ移籍したことによる実験計画の変更のため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
消耗品としてブルーネイテブおよびクリアネイテブ電気泳動用試薬購入費用、Affinity chromatography column 作製用の樹脂購入費用、トリプシンによるインゲル消化用費用、さらには質量分析費用などプロテオーム解析に充てる。
論文投稿に必要な英文校閲費、投稿費用等を予定している。研究成果発表のための国内、国際学会出席用旅費に一部充当する。研究の新たな展開として寄生蠕虫の生体外培養系の確立を目指しているが、そのための培養用試薬、培養機器の購入を予定している。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Collection methods of trematode eggs using experimental animal models.2016
Author(s)
Daigo Tsubokawa, Hiromu Sugiyama, Fusako Mikami, Katsumasa Shibata, Toshiyuki Shibahara, Koichi Fukuda, Shinzaburo Takamiya, Hiroshi Yamasaki, Takeshi Nakamura, Naotoshi Tsuji
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Journal Title
Parasitol. Int. Current Manual for Parasitological Research
Volume: 65, Part B
Pages: 584-587
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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