ADP-リボシル化毒素Cholixの宿主受容体を介した毒性発現機機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460526
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 八尋 錦之助 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80345024)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 細菌 / 毒素 / ADP-リボシル化 / 細胞障害

Research Abstract

コレラ菌由来外毒素Cholix toxin (Cholix) は、ADP-リボシルトランスフェラーゼ活性を有し、ヒト由来株化細胞HeLa 細胞に炎症性カスパーゼを起点としたアポトーシスを誘導する。
本研究は、ヒト細胞における新規な毒素受容体の同定、炎症性サイトカイン産生誘導機構とそれに伴う細胞致死機構の解析から、ヒト細胞致死機構の全容を明らかにすることを目的とする。
Cholixと相同性を示す緑膿菌ExoA は、炎症性サイトカインと相乗的に働き、マウス体内での肝障害を引き起こすことが報告されている.Cholix もExoAと同様にマウスへの投与により、肝障害を引き起こす。
そこで、本年度、ヒト肝臓細胞由来 HepG2 細胞を用い、Cholix toxin の細胞致死機構の解析を行った。炎症性サイトカインを添加することで、Cholix の細胞毒性の亢進が認められた。現在詳細に解析を行っている。
次に、我々が精製した Cholix を免疫して得られた抗体は非特異的な反応が強いため、新たに細胞内局在、受容体の同定を行うためCholix 特異的なペプチド抗体 (中央部分、C-末部分)2種類を作成した。この得られた抗体はウエンスタンブロティングでは特異的にCholix を認識した。現在、免疫染色、免疫沈降に使用可能か解析している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究に用いている細胞の増殖能が弱いため、アッセイに時間を有するため。
新たに抗体を作成するのに時間を要したため、やや遅れている考えられる。

Strategy for Future Research Activity

得られたペプチド抗体を用いて細胞内局在、受容体の同定を試みると共に、各種阻害剤 (MAP キナーゼ阻害剤等)の添加、サイトカインシグナルに関与する蛋白質の発現抑制が細胞致死機構に与える影響を解析、同定する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

細胞の培養に予定していた期間よりも時間を要したため、アッセイに時間がかかってしまった。そのため、計画していた実験がずれ込む形となり、次年度使用額が生じた。
細胞致死活性関連抗体、活性酸素種の発生の有無の検出行うキットを購入し、実験を行う予定である。