C型とD型ボツリヌス毒素変換ファージの尾部吸着タンパク質と宿主菌レセプターの解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460541
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 阪口 義彦 宮崎大学, IR推進機構, 助教 (70403491)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松崎 茂展 高知大学, 医歯学系, 准教授 (00190439) ; 内山 淳平 高知大学, 医歯学系, 助教 (20574619)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ボツリヌス菌 / 人畜共通感染症 / ボツリヌス毒素遺伝子 / バクテリオファージ / 水平伝播 / ファージ変換 / ゲノム解析 / プロテオーム解析

Research Abstract

C型とD型ボツリヌス菌は神経毒素を産生し、ヒトや動物に強力な致死作用を引き起こす。特に、畜産・食品産業では脅威となっている。その毒素遺伝子は、バクテリオファージ（ファージ）により伝播される。拡大するボツリヌス菌の被害を阻止するためには、ファージによる毒素遺伝子の伝播を抑制することが有効であると考えた。しかしながら、ボツリヌス毒素遺伝子を有するファージ（毒素変換ファージ）の宿主菌への吸着メカニズムは未だ不明である。本研究では、毒素変換ファージの宿主認識分子および宿主菌側レセプター分子の同定を行う。以前に、C型毒素変換ファージc-stの全ゲノム解析を行った。しかしながら、そのゲノムの大部分の遺伝子情報は未知であった。また、ボツリヌス毒素遺伝子を伝播するファージとしては、1種類のゲノム情報（c-stファージ）のみである。今年度は、1）c-stファージを構成するタンパク質をコードする遺伝子群の特定、2）同種ファージc-468との比較ゲノム解析を行い、ファージの生命維持に必要なコアゲノムの推定を行った。
1）C型毒素変換ファージの構造タンパク質の網羅的解析…精製c-stファージの粒子タンパク質を解析したところ、総計10個のOpen Reading Frame (ORF)が同定された。これらのORFは全てc-stファージゲノム上の99-157kbp領域に存在することが示唆された。
2）C型毒素変換ファージの全ゲノムと比較ゲノムの解析…比較ゲノム解析に使用するc-468ファージゲノムの全塩基配列の決定を行った。c-468ファージゲノムでは、43-57kbp領域が欠損していた。このことから、ある頻度でゲノムが縮小していることが明らかとなった。
今年度の結果から、C型毒素変換ファージの構造タンパク質をコードする遺伝子群を明らかにした。今後、解析を進め毒素遺伝子の伝播機構（ファージ変換）の解明を行いたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

既に、宮崎大学内では二種病原体等（ボツリヌス菌など）取扱施設として承認され、実験に必要な機器がほとんど備わっていたこと、実験に使用するボツリヌス菌および毒素変換ファージも保持していたことから、計画通りの実験を始めることができた。また、同大学内のフロンティアおよび人獣共通感染症教育・研究プロジェクトからの研究支援を受けられた。また、研究分担者である内山淳平氏と松崎茂展氏は、ファージに関する実験および解析技術を有していることから、本研究で問題が生じたときにはすぐに的確なサポートを受けられた。従って、研究の支援体制が非常に整っていたことから、効率よく実験が進められた。従って、進捗状況は良好である。

Strategy for Future Research Activity

1）C型毒素変換ファージの構造タンパク質の網羅的解析…c-stファージの構造タンパク質を同定し、その遺伝子群を特定した。しかしながら、精製c-stファージ粒子を電子顕微鏡で観察すると、菌体に内在している他のファージも確認された。ファージの構造タンパク質の解析には、c-stファージ以外のファージタンパク質が解析に干渉していると考えられる。従って、c-stファージタンパク質の解析が困難である。今後、c-stファージのプロテオーム解析に適したファージの培養条件を検討し、再度、c-stファージの網羅的プロテオーム解析を行う。
2）C型とD型毒素変換ファージの全ゲノムと比較ゲノムの解析…c-468ファージとc-stファージのゲノムサイズを比較すると、c-468ファージには異なるサイズのゲノム分子が存在したため、新たにゲノム配列を決定する必要があると考えられた。このことは、ファージ感染した宿主菌の継代培養を繰り返すことで、ゲノムの再編成が起きたことが考えられる。このような現象は極めてユニークであり、学術的に重要なことであると考察される。しかしながら、本現象を解明するには、PCR法では限界があり次世代シーケンサーで解析することが適当であると考えられ、c-468ファージゲノムの再解析を進めている。また、新規のD型毒素変換ファージd-1873の全ゲノム塩基配列を決定し、ゲノム構造の比較解析を行う。配列決定には、次世代シーケンサー（イルミナ、Myseq）を用いて行う。繰り返し配列が多い場合、配列決定が困難となることが予想されるので、次世代シーケンサー（Roche, 454 FLX Titanium）を用いる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

組換えファージ尾部吸着タンパク質の作製に必要な遺伝子導入装置は、当該年度の研究費では購入できなかったので、次年度に繰り越した。今年度は、応募申請書に記載した購入計画を変更し、遺伝子導入装置の購入を検討している。
1）組換えファージ尾部吸着タンパク質の作製…大腸菌または枯草菌の発現系を用いて、予想したファージ尾部吸着タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに構築する。構築したプラスミドのコンピテントセルへの導入は、大腸菌の場合、ヒートッショック法、枯草菌の場合、遺伝子導入装置を用いて行う。
2）ファージ吸着タンパク質の吸着能測定…宿主菌（ボツリヌス菌など）を吸引法により、PVDF膜へ固定する。HRP標識した組換えファージ吸着タンパク質を作製したPVDF膜に反応させ、ファージ尾部タンパク質の菌体に対する吸着を検討する。

Research Products

• [Journal Article] Draft genome sequence of Clostridium botulinum type B strain Osaka05, isolated from an infant patient with botulism in Japan (2014)
  • Author(s): Sakaguchi, Y., Hosomi, K., Uchiyama, J., Ogura, Y., Umeda, K., Sakaguchi, M., Kohda, T., Mukamoto, M., Misawa, N., Matsuzaki, S., Hayashi, T., Kozaki, S.
  • Journal Title: Genome Announcements Volume: 2(1) Pages: e01010-13
  • DOI: 10.1128/genomeA.01010-13
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage (2014)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Sakaguchi, Y., Gamoh, K., Kato, S., Daibata, M., Ujihara, T., Misawa, N., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: ISME J. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1038/ismej.2014.29
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Intracellular trafficking of Clostridium botulinum C2 toxin (2014)
  • Author(s): Nagahama, M., Takahashi, C., Aoyanagi, K., Tashiro, R., Kobayashi, K., Sakaguchi, Y., Ishidoh, K., Sakurai, J.
  • Journal Title: Toxicon Volume: 82 Pages: 76-82
  • DOI: 10.1016/j.toxicon.2014.02.009
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Analysis of botulinum neurotoxin type G gene-encoding plasmid in Clostridium argentinense (2014)
  • Author(s): Sakaguchi, Y., Uchiyama, J., Suzuki, T., Yamamoto, Y., Ogura, Y., Hosomi, K., Matsuzaki, S., Hayashi, T., Kozaki, S., Oguma, K.
  • Organizer: The 87th Annual Meeting of Japanese Society for Bacteriology
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20140326-20140328
• [Presentation] Examination of generalized transduction among Staphylococcus spp., using a novel phage S6 (2014)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Sakaguchi, Y., Misawa, N., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: The 87th Annual Meeting of Japanese Society for Bacteriology
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20140326-20140328
• [Presentation] Estimation of Helicobacter pylori phage ecology (2014)
  • Author(s): Matsuzaki, S., Uchiyama, J., Takeuchi, H., Takemura-Uchiyama, I., Sakaguchi, Y., Ujihara, T., Daibata, M.
  • Organizer: The 87th Annual Meeting of Japanese Society for Bacteriology
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20140326-20140328
• [Presentation] Phage therapy experiment against staphylococcal lung-derived septic mouse model (2014)
  • Author(s): Takemura-Uchiyama, I., Uchiyama, J., Sakaguchi, Y., Ujihara, T., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: The 87th Annual Meeting of Japanese Society for Bacteriology
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20140326-20140328
• [Presentation] Estimated distribution of KHP30-like bacteriophages in the stomach, using clinical Helicobacter pylori isolates (2014)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takeuchi, H., Sakaguchi, Y., Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Gamoh, K., Ujihara, T., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: The 12th Japan-Korea International Symposium on Microbiology (XII-JKISM)
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20140324-20140325
• [Presentation] Examination of generalized transduction among Staphylococcus spp. using a novel phage S6 (2014)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Sakaguchi, Y., Gamoh, K., Misawa, N., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: The 13th KMS Research meeting
  • Place of Presentation: Kochi, Japan
  • Year and Date: 20140219-20140220
• [Presentation] Phage therapy experiment against staphylococcal lung-derived septic mouse model (2014)
  • Author(s): Takemura-Uchiyama, I., Uchiyama, J., Sakaguchi, Y. Ujihara, T., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: The 13th KMS Research meeting
  • Place of Presentation: Kochi, Japan
  • Year and Date: 20140219-20140220
• [Presentation] 新規ファージ S6 によるブドウ球菌間の普遍形質導入の検討 (2013)
  • Author(s): 内山淳平、内山(竹村)伊代、阪口義彦、三澤尚明、大畑雅典、松崎茂展
  • Organizer: 第66回日本細菌学会中国・四国支部総会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 20131012-20131013
• [Presentation] 新奇ファージS6の分離とブドウ球菌における普遍形質導入の検討 (2013)
  • Author(s): 内山淳平、内山（竹村）伊代、蒲生恵司、阪口義彦、三澤尚明、大畑雅典、松崎茂展
  • Organizer: 第58回日本ブドウ球菌研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20130927-20130928
• [Presentation] 黄色ブドウ球菌性肺感染症に対するファージ療法の可能性の検討 (2013)
  • Author(s): 松崎茂展、内山淳平、内山（竹村）伊代、阪口義彦、加藤 伸一郎、氏原隆子、大畑雅典
  • Organizer: 第58回日本ブドウ球菌研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20130927-20130928
• [Presentation] Analysis of botulinum neurotoxin-encoding plasmid in of Clostridium argentinense (2013)
  • Author(s): Sakaguchi, Y., Uchiyama, J., Suzuki, T., Yamamoto, Y., Ogura, Y., Sakaguchi, M., Tsuda, C., Matsuzaki, S., Hayashi, T., Oguma, K.
  • Organizer: FEMS2013, The 5th Congress of European Microbiologists
  • Place of Presentation: Leipzig, Germany
  • Year and Date: 20130721-20130725
• [Presentation] Phage therapy experiment for staphylococcal lung infection (2013)
  • Author(s): Uchiyama, J., Sakaguchi, Y., Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Ujihara, T., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: FEMS2013, The 5th Congress of European Microbiologists
  • Place of Presentation: Leipzig, Germany
  • Year and Date: 20130721-20130725
• [Presentation] A novel type of spherical bacteriophage, Helicobacter pylori bacteriophage KHP30 (2013)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takeuchi, H., Sakaguchi, Y., Gamo, K, Kato, S., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: FEMS2013, The 5th Congress of European Microbiologists
  • Place of Presentation: Leipzig, Germany
  • Year and Date: 20130721-20130725
• [Presentation] Bacterial detection system for Staphylococcus aureus based on bacteriophage tail adsorption protein (2013)
  • Author(s): Uchiyama, J., Uchiyama-Takemura, I., Watanabe, S., Sakaguchi, Y., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: The 28th International Congress of Chemotherapy and Infection (ICC), Incorporating the 14th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection
  • Place of Presentation: Yokohama, Japan
  • Year and Date: 20130605-20130608
• [Presentation] B型ボツリヌス菌が保有するプラスミドの芽胞形成への関与
  • Author(s): 細見晃司、阪口義彦、後藤和義、幸田知子、飯田哲也、小崎俊司、向本雅郁
  • Organizer: 第66回日本細菌学会関西支部総会
  • Place of Presentation: 大阪
• [Book] 化学療法の領域、III嫌気性菌、破傷風とボツリヌス症 (2013)
  • Author(s): 小熊惠二、阪口義彦、杉本 央、山本 由弥子
  • Total Pages: 29(10)、115-124
  • Publisher: 医薬ジャーナル社