C型とD型ボツリヌス毒素変換ファージの尾部吸着タンパク質と宿主菌レセプターの解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460541
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 阪口 義彦 北里大学, 医学部, 助教 (70403491)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松崎 茂展 高知大学, 教育研究部医療学系, 准教授 (00190439) ; 内山 淳平 高知大学, 教育研究部医療学系, 助教 (20574619)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ボツリヌス菌 / 人畜共通感染症 / ボツリヌス毒素遺伝子 / バクテリオファージ / 水平伝播 / ファージ変換 / ゲノム解析 / プロテオーム解析

Outline of Annual Research Achievements

C型とD型ボツリヌス毒素（神経毒素）による畜産・食品産業への被害は、脅威となっている。C型とD型毒素遺伝子は、バクテリオファージ（毒素変換ファージ）により伝播されている。その伝播を阻害することにより、畜産・食品への被害を抑えるのに有効であると考えた。しかしながら、毒素変換ファージのボツリヌス菌（宿主菌）への吸着メカニズムは未だ明らかでない。本研究では、C型毒素変換ファージ、c-stファージの宿主認識分子および宿主菌側レセプター分子の同定を行う。今年度は、1）c-stファージの2価金属イオンに対する安定性、2）c-stファージのプラーク形成の条件検討、3）組換えc-stファージ尾部タンパク質の作製について行った。
1）c-stファージの尾部の鞘が壊れやすいことから、2価金属イオン（Ca2+またはMg2+）添加によるファージの安定性について調べた。培地にCaCl2、MgCl2、またはその両者を加え、電子顕微鏡によるファージ粒子の形態観察とファージタンパク質のN末端アミノ酸配列解析を行った。その結果、ファージの尾部の鞘への安定性を示さなかった。また、c-stファージの宿主菌への溶菌には影響しなかった。
2）c-stファージの宿主菌への吸着を調べるため、本ファージのプラークを作製することにした。ボツリヌス菌は偏性嫌気性菌であり、酸素の存在下では増殖できない。そこで、ガスパック法により嫌気的培養の条件検討を行ったが、宿主菌のローンを作ることが非常に困難であった。ガスパック法では、酸素を置換するのに時間を要することが原因であると考えられる。今後、真空ポンプによるガス置換法の検討を行う。
3）c-stファージのゲノム情報から、枯草菌SPβファージタンパク質および溶菌酵素と高い相同性を示す遺伝子を発現ベクターに挿入し、プラスミドを構築した。現在、大腸菌発現系を用いて、組換えタンパク質の発現の条件検討を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

宮崎大学獣医学科の二種病原体等（ボツリヌス菌など）取扱施設を利用することができた。また、宮崎大学産業動物防疫リサーチセンターからの研究支援を受けられた。実験材料のボツリヌス菌、バクテリオファージ（ファージ）を保持していたこと、実験に使用する機器などが備わっていたことから、計画通りの実験を進めることができた。研究分担者の松崎茂展氏と内山淳平氏から、ファージに関する実験および解析技術の的確なサポートを受けられた。従って、研究の支援体制が非常に整っていたことから、効率よく実験が進められた。今年度末には、宮崎大学から北里大学への移設作業に時間を要したが、これまでの実験室のセットアップのノウハウを活かし、北里大学では継続した実験を進めることが可能となっている。既に、北里大学では遺伝子組換え実験安全委員会の承認が得られていることから、ファージ尾部吸着タンパク質の同定に関する実験を進める準備ができている。

Strategy for Future Research Activity

1. C型とD型毒素変換ファージのゲノム解析…次世代シーケンサー（イルミナMiSeq、ロッシュ454 FLX Titanium）を用いて、C型とD型毒素変換ファージの全ゲノム塩基配列の決定を行う。得られた配列情報をもとに、ファージタンパク質の網羅的解析を行う。
2. c-stファージ尾部吸着タンパク質の同定、1）c-stファージ尾部吸着タンパク質の作製…組換えc-stファージ尾部吸着タンパク質の発現（培養温度、培養時間など）と精製の条件検討を行う。2）ファージ吸着タンパク質の吸着能測定…HRP標識したファージ吸着タンパク質をPVDF膜へ固定したボツリヌス菌に反応させ、ファージ尾部タンパク質の菌体に対する吸着を検討する。3）抗体の作製…組換えファージ吸着タンパク質をウサギに免疫し、抗ファージ吸着タンパク質抗体を作製する。4）免疫電子顕微鏡法…精製したファージ粒子を作製した精製抗ファージ吸着タンパク質抗体（一次抗体）と金コロイド結合抗ウサギ抗体（二次抗体）を反応させ、電子顕微鏡により観察する。5）ボツリヌス菌側レセプター分子の同定…ファージ尾部吸着タンパク質結合ラテックスビーズと菌体成分（ボツリヌス菌の細胞壁構成成分を薬剤処理したもの）を混合し、凝集性の違いにより結合する細菌側レセプター分子を特定する。

Causes of Carryover

当初、研究計画していた次世代シーケンサー（イルミナMiSeq、ロッシュ454 FLX Titanium）を用いたC型とD型毒素変換ファージの全塩基配列の決定に費用がかかるため、今年度は、応募申請書に記載した計画を変更し、次年度に繰り越し、研究を遂行することにした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

1）C型またはD型菌からDNAを精製し、次世代シーケンサー(イルミナMiSeq、ロッシュ454 FLX Titanium)を用いて、全ゲノム塩基配列の決定を行う。得られた配列情報をDNAシーケンスアセンブルソフトウェア(Gene Codes) により解析する。
2）分子生物学・配列解析ソフトウェア（インシリコモレキュラークローニング）を使用して、公共のデータベース（Genbank）を利用し、ゲノム上のそれぞれの遺伝子(orf)を推定する。また、GenomeMatcherを用いて、近縁ファージゲノム構造の比較を行う。

Research Products

• [Journal Article] Genome analysis of Pseudomonas aeruginosa bacteriophage KPP23, belonging to the family Siphoviridae. (2014)
  • Author(s): Yamaguchi, K., Miyata, R., Shigehisa, R., Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Ujihara, T., Sakaguchi, Y., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: Genome Announc. Volume: 2(3) Pages: e00233-14
  • DOI: 10.1128/genomeA.00233-14
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Characterization of a novel Pseudomonas aeruginosa bacteriophage, KPP25, of the family Podoviridae. (2014)
  • Author(s): Miyata, R., Yamaguchi, K., Uchiyama, J., Shigehisa, R., Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Ujihara, T., Sakaguchi, Y., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Journal Title: Virus Res. Volume: 189 Pages: 43-46
  • DOI: 10.1016/j.virusres.2014.04.019
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] DNAX-activating protein 10 (DAP10) membrane adaptor associates with receptor for advanced glycation end products (RAGE) and modulates the RAGE-triggered signaling pathway in human keratinocytes. (2014)
  • Author(s): Sakaguchi, M., Murata, H., Aoyama, Y., Hibino, T., Putranto, E. W., Ruma, I. M., Inoue, Y., Sakaguchi, Y., Yamamoto, K., Kinoshita, R., Futami, J., Kataoka, K., Iwatsuki, K., Huh, N. H.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 289(34) Pages: 23389-23402
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.573071
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Complete nucleotide sequence of a plasmid containing the botulinum neurotoxin gene in Clostridium botulinum type B strain 111 isolated from an infant patient in Japan. (2014)
  • Author(s): Hosomi, K., Sakaguchi, Y., Kohda, T., Gotoh, K., Motooka, D., Nakamura, S., Umeda, K., Iida, T., Kozaki, S., Mukamoto, M.
  • Journal Title: Mol. Genet. Genomics Volume: 289(6) Pages: 1267-1274
  • DOI: 10.1007/s00438-014-0887-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Analysis of botulinum neurotoxin type B6 gene-encoding plasmid in Clostridium botulinum type B (2015)
  • Author(s): Sakaguchi, Y., Uchiyama, J., Hosomi, K., Kohda, T., Matsuzaki, S., Ogura, Y., Hayashi, T., Hayashi, S., Kozaki, S., Mukamoto, M.
  • Organizer: 第88回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 長良川国際会議場（岐阜県岐阜市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] 各種ファージに対する黄色ブドウ球菌受容体の解析 (2015)
  • Author(s): 内山淳平、黒川健児、阪口義彦、内山（竹村）伊代、氏原隆子、村上雅尚、大畑雅典、松崎茂展
  • Organizer: 第88回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 長良川国際会議場（岐阜県岐阜市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] 緑膿菌感染症に対するファージ療法と化学療法の併用療法の可能性検討 (2015)
  • Author(s): 重久 立、内山淳平、宮田怜奈、山口琴絵、内山伊代、阪口義彦、氏原隆子、大畑雅典、松崎茂展
  • Organizer: 第88回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 長良川国際会議場（岐阜県岐阜市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [Presentation] ピロリ菌におけるKHP30様ファージの溶原性に関する研究 (2014)
  • Author(s): 内山淳平、内山（竹村）伊代、阪口義彦、竹内啓晃、村上政尚、氏原隆子、大畑雅典、松崎茂展
  • Organizer: 第67回日本細菌学会中国・四国支部総会
  • Place of Presentation: 徳島文理大学薬学部（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2014-10-04 – 2014-10-05
• [Presentation] Generalized transduction experiment in vitro among Staphylococcus spp., using a novel giant phage S6. (2014)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Sakaguchi, Y., Kato, S., Gamoh, K., Misawa, N., Murakami, M., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: 第5回ファージ研究会
  • Place of Presentation: 三重大学生物資源学部（三重県津市）
  • Year and Date: 2014-09-04 – 2014-09-05
• [Presentation] Analysis of botulinum neurotoxin type G gene-encoding plasmid in Clostridium argentinense strain 2740. (2014)
  • Author(s): Sakaguchi, Y., Uchiyama, J., Suzuki, T., Yamamoto, Y., Hosomi, K., Kohda, T., Matsuzaki, S., Hayashi, T., Mukamoto, M., Oguma, K.
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies (IUMS)
  • Place of Presentation: Montreal Convention Center (Montreal, Canada)
  • Year and Date: 2014-07-27 – 2014-08-01
• [Presentation] Generalized transduction in vitro among Staphylococcus spp., using a novel phage S6. (2014)
  • Author(s): Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Sakaguchi, Y., Kato, S., Gamoh, K., Misawa, N., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies (IUMS)
  • Place of Presentation: Montreal Convention Center (Montreal, Canada)
  • Year and Date: 2014-07-27 – 2014-08-01
• [Presentation] KHP30-like phages among clinical isolates of Helicobacter pylori. (2014)
  • Author(s): Takemura-Uchiyama, I., Uchiyama, J., Takeuchi, H., Gamoh, K., Sakaguchi, Y., Kato, S., Ujihara, T., Daibata, M., Matsuzaki, S.
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies (IUMS)
  • Place of Presentation: Montreal Convention Center (Montreal, Canada)
  • Year and Date: 2014-07-27 – 2014-08-01