2013 Fiscal Year Research-status Report
ヒト免疫不全ウイルスがウイルスRNAの核外輸送経路を取捨選択する意義
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25460564
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
谷口 一郎 京都大学, ウイルス研究所, 助教 (00467432)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ヒト免疫不全ウイルス / RNA核外輸送 / RNA‐タンパク質複合体 / mRNA前駆体スプライシング |
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| Research Abstract |
ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の感染後期に転写されるRNA群（例えば9-kb RNA）は、異なる2種類の機構（CRM1経路とTAP経路）によって核外へ輸送されうる。しかし申請者らは、それらのRNAの輸送において、TAP経路の利用が、ウイルスタンパク質のRevによって回避されていることを発見した。ただし、なぜHIV-1がTAP経路の利用をわざわざ回避するのかは不明であった。
この疑問を明らかにするため、ウイルスRNAの核外輸送においてTAP経路を強制的に誘導させることを試みた。そのため、ウイルスRNAを発現する培養細胞HEK293TにTAPとその結合タンパク質p15を同時に過剰発現させた。その結果、ウイルスタンパク質Gagの量が減少した。この原因を明らかにするため、Gagをコードする9-kb RNA量を半定量的RT-PCRによって調べた。その結果、Tap-p15の過剰発現によって、9-kb RNAの量が減少することがわかった。以上の結果は、9-kb RNAの核外輸送にTAP経路が誘導すると、ウイルスの複製に悪影響を及ぼすことを意味している。したがって、その悪影響から免れるためにTAP経路の利用を回避するというウイルスの戦略が考えられた。
ここで、TAP経路の誘導がウイルスRNA量の減少を引き起こす仕組みが新たな疑問として浮上した。9-kb RNAはイントロンを持ったまま核外輸送されることから、TAP経路による減少にはスプライシング反応の寄与が考えられた。このことを調べるため、スプライシング反応阻害剤であるSSA存在下で同様の実験を行った。その結果、SSA存在下でもTAP-p15過剰発現によって9-kb RNAは減少したことから、スプライシング反応には依存しないことが示唆された。
以上の結果を論文にまとめ、Nucleic Acids Research誌に投稿し受理された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、TAP過剰発現によるGagタンパク質量の減少が何に起因するかを、平成25年度に明らかにすることを予定していた。その可能性として、Gagタンパク質をコードする9-kb RNA量がTAP過剰発現によって減少することを推測していたが、実際にこのことが起こっていることを明らかにした。さらに9-kb RNAの減少がスプライシング反応に依存しないことを示唆する結果も得た。これまでに得られていた結果と、平成25年度に明らかにしたことを併せて論文報告するに至った。
したがって、本研究はおおむね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
TAP過剰発現によるウイルスの9-kb RNA量の減少が何に起因するかを明らかにしたい。平成25年度では、この現象はスプライシング反応に依存しないことを示唆する結果を得た。この実験では、ウイルスのTatタンパク質によってHIV-1のLTRからウイルスRNAが転写される系を用いていた。したがって、スプライシング阻害剤SSAによって、Tatタンパク質量も減少していることが考えられ、SSAありなしで、ウイルスRNAの転写量が異なっている可能性がある。つまりこの実験系では、転写量が変化することによる二次的影響を排除しきれていない。
そこで平成26年度では、転写による二次的効果を排除するため、Tatに依存しないウイルスRNAの転写系を作製する。具体的には、Tatの開始コドンに変異を導入して、ウイルスRNAからTatが発現しないようにする。これだけでは効率のよい転写は起こらないので、さらに、プロモーターにはLTRではなく、CMVプロモーターを用いる。このようなプラスミドを作製して、HEK293T細胞へトランスフェクションを行い、TAP過剰発現とSSAの効果を調べる。
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