2013 Fiscal Year Research-status Report
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25460572
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
佐々木 潤 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (70319268)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ピコルナウイルス / ウイルスゲノム複製 / 宿主因子 |
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| Research Abstract |
我々はこれまで、胃腸炎関連のピコルナウイルス、アイチウイルス(AiV)のゲノム複製機構の解明のための研究を行ってきた。本研究では、最近我々が発見した、AiV複製時に形成されるAiVタンパク質(2B,2BC,2C,3A,3ABのどれか)/ACBD3/PI4KB複合体について、ゲノム複製における詳細な機能解析に加え、複製複合体形成やゲノム複製に関わる新たな宿主因子の探索を行う。今年度は、AiV複製や複製複合体形成におけるAiVタンパク質/ACBD3/PI4KB複合体の機能解析および宿主タンパク質の役割について解析を行った。まず、複製複合体形成における宿主タンパク質の役割を明らかにするために、AiVポリプロテイン発現細胞をACBD3に対するsiRNAやPI4KB阻害剤で処理した後、AiVタンパク質、ACBD3,PI4KB,PI4Pを免疫染色し、siRNAや阻害剤無処理の場合と膜構造の変化を比べた。その結果、無処理の場合ドット状の膜構造上でAiVタンパク質とACBD3,PI4KB,PI4Pの共局在が観察されたが、ACBD3に対するsiRNA処理やPI4KB阻害剤処理により、これらの共局在が失われた。この結果はAiVタンパク質/ACBD3/PI4KB複合体を介したPI4P合成が複製複合体形成に重要であることを示唆する。
さらに、AiVタンパク質2B,2BC,2C,3A,3AB単独発現細胞におけるPI4P量をドットブロットにより調べた結果、いずれの場合もPI4P量が非発現細胞に比べて増加しており、これらのAiVタンパク質が細胞のPI4P産生量を増加させることが明らかとなった。加えて、in vitro kinase assayによりAiVタンパク質のうち3AのPI4KB活性化を検討した結果、3AだけではPI4KBを活性化しなかったが、そのキナーゼ反応液にさらにACBD3を加えることでPI4KB活性化が確認された。この結果は、3A/ACBD3/PI4KB複合体形成がPI4KBを活性化することを示唆する。
以上、今年度は、AiVタンパク質/ACBD3/PI4KB複合体形成がPI4KB活性化を通してPI4P産生を亢進し、複製複合体形成に重要であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究計画として、以下の4テーマを設定していた。
1） AiVに関してPI4Pと3Dポリメラーゼとの相互作用を解析する。2） ウイルスタンパク質/ACBD3/PI4KB複合体のPI4KBのキナーゼ活性亢進能の有無を調べる。3） 複製複合体形成や膜構造変化におけるACBD3やPI4KBの役割を解析する。4） 複製複合体形成およびゲノム複製に関与する、新たな宿主因子の探索と機能解析を行う。
これらのうち、1）については、実験を行ったが、PI4Pと3Dポリメラーゼが相互作用するというデータは現時点では得られていない。AiVの場合、エンテロウイルスと異なり、PI4Pと3Dは相互作用しないという結論を確定するためには、今後さらに実験が必要であるかもしれない。2）および3）については結果を得ることができ、論文としてまとめて発表した (Ishikawa-Sasaki et al., J. Virol. 印刷中)。4)についても実験を始めており、新たな宿主因子の候補を見出すことが出来ている。したがって、現時点では、おおむね研究計画通りに進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、AiVの複製複合体形成およびゲノム複製に関与する、新たな宿主因子の探索と機能解析を行う。特に、ウイルス複製部位に産生されるPI4Pのウイルス複製や複製複合体形成における役割を明らかにする目的で、PI4P結合タンパク質や、PI4Pが関与する膜輸送や脂質輸送に関連するタンパク質を中心に、解析を行う。このようなタンパク質の解析を今年度から開始しており、新たな宿主因子の候補を見出している。次年度以降、この候補タンパク質およびこの候補タンパク質と相互作用するような宿主タンパク質について詳細な機能解析（相互作用解析、細胞内局在解析など）を行う。また、近年、エンテロウイルスやフラビウイルスで、PI4P以外の脂質（脂肪酸やコレステロールなど）もウイルス複製に関与するという報告がなされている。PI4Pは細胞内脂質輸送にも関与しているため、AiV感染細胞における脂質輸送の解析も行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度行った実験により新たに見出された宿主因子候補タンパク質について、詳細な機能解析の実験を次年度早い時期に行うため、そのための試薬を購入する費用に充てる目的による。
今年度、新たに見出した宿主因子候補タンパク質についての機能解析やタンパク質間相互作用解析のための試薬や抗体、脂質輸送の解析のための試薬や阻害剤などの購入を計画している。
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