2014 Fiscal Year Research-status Report
創薬開発に向けたウイルススーパーファミリー１ヘリカーゼの構造と機能に関する研究
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25460576
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| Research Institution | National Institute of Agrobiological Sciences |
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Principal Investigator |
加藤 悦子 独立行政法人農業生物資源研究所, 生体分子研究ユニット, 研究員 (00355752)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ウイルス / ヘリカーゼ / タンパク質 / SAXS / ITC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スーパーファミリ１（SF1）ヘリカーゼは、多くの農学上および獣医学上重要なウイルスにコードされている。しかし、その立体構造や原子レベルでの機能は不明な点が多い。近年、我々はトマトモザイクウイルス（ToMV）がコードするSF1ヘリカーゼの安定領域（ToMV-Hel）を決定し、その立体構造の決定に成功した。同様に、他のウイルスがコードするSF1ヘリカーゼの構造と機能が解明できれば、その共通性や相違点から、ウイルスSF1ヘリカーゼの機能を明らかするとともに、将来的に創薬開発に対しての基盤情報となることが期待できる。
本申請課題では、ToMVと同様にSF1ヘリカーゼをコードする4種類ウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、風疹ウイルス、豚流行性下痢ウイルス(PEDV)）について、i) 発現系の構築、ii) 精製方法の確立、精製タンパク質が得られたタンパク質については、iii) NTPase活性の評価、iv) 結晶化の検討、v) X線溶液散乱(SAXS)実験を行った。HEVおよび風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現系の構築はできたが、発現量が少なく精製タンパク質を得ることはできなかった。VEEVのヘリカーゼドメインを含むタンパク質（VEEV-nsP2:ヘリカーゼドメイン+プロテアーゼ）については、精製タンパク質が効率よく得られ、SAXSによる解析により低分解能構造が得られた。現在、条件の違いによる構造変化の有無について実験を進めている。SAXSの結果では、精製VEEV-nsP2は単分散で良好な溶液状態にあることが分かったが、現時点で結晶化には成功していない。次年度以降も結晶化条件の検討を行う予定である。PEDVのヘリカーゼドメインを含むタンパク質（PEDV-nsp10:金属結合ドメイン+ヘリカーゼドメイン）についての研究は大きく進展した。純度の高いタンパク質の精製方法を確立し、結晶化条件の検討を行い、タンパク質と思われる結晶を得た
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画当初は、VEEV-nsP2の結晶化条件の検討、HEV、風疹ウイルスのヘリカーゼドメインおよびPEDV-nsp10の発現条件および精製条件の検討を進める予定であった。研究を進めた結果、HEV および風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現系の構築は予定通り進めることができたが、目的タンパク質の発現量が少なく精製に成功することができなかった。一方、現在感染が問題になっているPEDVについては、PEDV-nsp10の精製に成功することができた。この精製タンパク質は等温滴定型カロリメトリーを用いた実験の結果、NTPase活性を有することが明らかになったことから、活性型の構造を形成していると考えられた。また、NTPase活性の基質選択性の傾向はToMV-HelやVEEV-nsP2とは大きく異なっていることが明らかとなった。そこで、PEDVのヘリカーゼドメインのモデリング構造とToMVの結晶構造、およびそれぞれのアミノ酸配列を詳細に比較した結果、PEDVには非ウイルスのSF1ヘリカーゼにみられるQ-motifが存在する可能性が示唆された。さらに、この精製タンパク質を用いて結晶化条件を検討した結果、目的タンパク質と思われる結晶を得ることに成功した。これらPEDV-nsp10に関する成果は、当初の目的以上の成果である。VEEVについては、結晶化条件が見つからず結晶構造解析が進んでいないが、SAXSによる低分解能構造の決定に成功した。PEDVおよびVEEVのヘリカーゼドメインについての研究については、目標を上回る成果を得られた。ToMV-Helとアミノ酸相同性の高いウイルス（同じVirgaviridaeに属するウイルスや属が異なるBrome mosaic virus, Beet Yellow virusなど）については、モデリング構造の構築を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
PEDV-nsp10の結晶について、早急にX線回折実験を行い、良好な実験データが得られた場合には、結晶構造の解析を進める。また、並行してNTPとの結合型などいくつかの条件によるSAXS実験を進め、動的構造解析も進める。構造が得られた場合には、PEDVのヘリカーゼドメインを含むタンパク質ドメインのNTPase活性発現機構について、詳細な解析を行う。特にQ-motifに含まれるグルタミン残基の重要性については、変異体を作製するなどして、その活性発現機構を原子レベルで解明する。
VEEVについては、SAXSによるフリー体の低分解能構造が得られている。また、ATP結合体では構造が異なることが示唆されるデータも得られているので、早急にSAXSによるATP結合体の低分解能構造を得るための実験を進める予定である。
上記の構造情報や、ToMV-Helとアミノ酸相同性の高いウイルスについてのモデリング構造について、ToMV-Helの比較を行い、機能発現機構について検討する。具体的には、既にToMV-Helの解析結果から明らかになった、または予想される領域（NTP結合領域、RNA結合領域、宿主認識領域）に位置する残基の比較や表面特性について詳細に検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
消耗品の購入が少なかったことと、当初2件の学会に参加する予定であったが、1件に変更したため、使用額が少なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究が順調に進んでいるので、研究に必要な試薬および消耗品の購入を計画している。また、研究成果を発表する学会参加費や論文の校閲代および投稿料に使用する。PEDV-nsp10の結晶の測定結果次第では、SPring8での測定が必要となるため、そのための旅費として使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
