2013 Fiscal Year Research-status Report

ANGPTLによる免疫グロブリン様受容体を介した免疫制御機構の解析

Research Project

Project/Area Number	25460595
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	University of the Ryukyus
Principal Investigator	海川正人琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00325838)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	Angptl2 / マクロファージ
Research Abstract	本研究では Angptl2 が抑制性免疫グロブリン様受容体を介して、免疫担当細胞にどのような作用を与えるか解析し、その分子メカニズムを明らかにする事を目的とした。まず、活性を持った Angptl2 蛋白質を実験に用いる為、末端に Flag タグ配列を付加した Angptl2 遺伝子をコードするレトロウイルスを作成し、293T 培養細胞に感染させ、Angptl2 を安定して産生する培養細胞株を樹立した。培養液中に分泌される修飾型の Angptl2-Flag 蛋白質を抗 Flag 抗体を用いて精製することで、Angptl2-Flag 蛋白質を安定して供給する系を確立した。次に、LILRB2 のマウスホモログ PirB を発現している免疫担当細胞であるマクロファージを対照に Angptl2 の作用を解析した。マウス骨髄細胞を GM-CSF により M1 型マクロファージ様細胞に分化させ、Angptl2-Flag を加えたところ、形態的な変化は見られず、TNFa、IL-6、IL-10 などのサイトカインの産生も見られなかった。また、LPS 刺激による形態変化、TNFa などのサイトカインの産生誘導にも、ほとんど影響を与えず、マイクロアレイによる遺伝子発現解析でも注目すべき差は認められなかった。M-CSF で分化させた M2 型マクロファージ様細胞に対しては、形態的にも、TNFα、IL-6、IL-10 などのサイトカインの産生に対し、なんら影響を与える事はなかったが、NFκB が核移行することが明らかとなった。以上より、Angptl2 は、M2 型のマクロファージに対して、何らかの未知の作用があると考えられ、現在、M2 型のマクロファージを対象とし、Angptl2 の作用の解析を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度は、予定通り Angptl2 蛋白質の大量精製の系を確立し、転写調節因子の核移行だけではあるが、Angptl2 に対して反応を示す免疫担当細胞を見出した事から、おおむね順調に進展していると考えている。
Strategy for Future Research Activity	Angptl2 刺激により、炎症性遺伝子の発現を誘導する転写因子が活性化されることから、Angptl2 がどのような経路で、この転写因子を活性化するか、また、その下流でどのような遺伝子の発現が調節されているか明らかにする。そのため、 Angptl2 処理したAngptl2 反応性細胞の細胞内蛋白質を経時的に回収し、IKK、NFκB、Akt、ASK、ERK、JNK、Stat3 などのシグナル分子の活性化状態を解析し、どのシグナル経路が働いているかを明らかにする。また、未知のシグナル因子の関与も考えられるため、Angptl2 刺激後に細胞のリン酸化蛋白質を分離し、ディファレンシャル２次元電気泳動によって細胞内の蛋白質のうち、リン酸化状態に変化の見られるシグナル蛋白質を同定する。また、核蛋白質を分離し、同様の方法で、Angptl2 の下流で働く転写因子の同定を試みる。さらに、分子生物学的アプローチとして、Angptl2 処理した細胞の mRNA を回収し、マイクロアレイ法により、Angptl2 処理により発現に変化の見られる遺伝子を探索する。LPS や GM-CSF などのサイトカイン刺激によって、発現に変化の見られる遺伝子群との比較などから Angptl2 の関与するシグナル系の同定を試みる。また、PirB の関与を明らかにするため、PirB ノックダウン細胞を作出し、Angptl2 処理による転写因子の活性化への影響を解析する。以上の検討により、Angptl2 の免疫担当細胞制御の分子機構を明らかにすることで、Angptl2 が、炎症などの生理現象にどのように関わっているかを解明できるよう研究を推進する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	25 年度にマイクロアレイ解析を複数サンプル解析依頼する予定であったが、26 年度より所属大学にマイクロアレイ解析装置が導入される事になった。そのため、26 年度以降に導入される機器を用いて解析すれば、より多くの解析を安価に実行できる事から、解析の一部を 26 年度に行うよう計画を変更し、解析にかかる予算を次年度に持ち越すこととした。新たに導入されたマイクロアレイ解析装置を用いて、様々な細胞の Angptl2 刺激による遺伝子発現変化を解析するために必要な試薬、および、アレイチップ等の消耗品の購入に使用する。