2014 Fiscal Year Research-status Report
エピジェネティック制御因子EedによるT細胞機能制御機構の解明
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25460599
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
内藤 拓 東邦大学, 医学部, 講師 (10568728)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | T細胞分化 / TGFβ / IEL / Treg / Eed |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H3K27メチル化は遺伝子発現制御を介した細胞の自己同一性維持に重要であることから、本年度はH3K27のメチル化を触媒するPRC2複合体の必須サブユニットであるEedを欠損したヘルパーT細胞のサブセット分化に特に注目して解析した。ナイーブCD4陽性T細胞をTGFβ存在下で培養すると、野生型ではそのほとんどがFoxp3陽性となる。しかしEedを欠損した場合、Foxp3陽性かつCD8陽性の細胞へと分化する。この過程はIFNγの添加により促進されることから、iIEL分化の異常な脱抑制であることが示唆された。iIELへの分化にはRunx3の関与が報告されているためCbfb欠損によりRunx複合体の機能をさらに欠損させたが、CD8の発現上昇は部分的にしか抑制されなかった。またCFSE染色との解析から、この分化には細胞周期の進行は必須でないことも示された。これらの結果はTGFβ依存的な分化経路選択の制御にEedが重要であることを示唆している。
またこれまでにEed欠損によりTCRシグナル伝達が障害され、およびその結果と思われる胸腺での正の選択およびアゴニスト選択を受けるnIEL, nTregの分化障害を見いだした。本年度はそれに加え、アゴニスト選択を受けるもう一つのT細胞系譜であるiNKTについても解析を行い、Eed欠損によりiNKT分化が強く障害されることを見いだした。また負の選択についても部分的に障害があることも明らかとなった。興味深いことに正の選択、負の選択と比較してアゴニスト選択がより強く障害されていた。また細胞質に優先的に局在するEed変異体を発現するマウスを作成し解析したところ、正の選択が亢進し、nIELおよびiNKTのアゴニスト選択も増強されるという予備的な結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はT細胞特異的Eed欠損がヘルパーT細胞サブセット分化、とりわけ共にTGFβ依存するTregおよびIELへの分化調節を行っていることを強く示唆するデータを得た。PRC2複合体によるこのような役割はこれまで報告されておらず、免疫制御におけるPRC2複合体の新たな機能を明らかにしたものとして当初の研究目的に沿った成果と言える。
また核質特異的Eed欠損のシステムを構築しその解析を始めたが、核質特異的Eed欠損細胞では核内のH3K27トリメチル化が減少していることが明らかとなった。さらに細胞質特異的Eedの発現はEedの単純欠損で見られる正の選択の部分障害をレスキューすることも示唆された。これらの結果は核質特異的Eed欠損システムが当初の計画通りに働いていることを支持しており、次年度でのさらなる解析に期待が持てるデータと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度ではEedによるTreg/IEL分化制御の生理的役割に焦点を当てて研究を進める予定である。まずEed欠損マウス内で実際にTreg/IEL間の運命分岐の異常が起きうるかを明らかにするため、経口免疫寛容誘導系でTreg分化を促進したときにEed欠損細胞で異常が見られるか検討する。具体的には野生型またはEed欠損OT-IIトランスジェニックCD4陽性T細胞を養子移入してOVAタンパクを経口投与後、腸間膜リンパ節及び粘膜固有層より移入細胞を回収し解析する。また分化異常の分子機構を明らかにするため、転写因子T-betの関与の有無についてドミナントネガティブ型T-betを用いて検討を行う。さらに野生型とEed欠損細胞の間で、TGFβ下流の転写因子であるSMADの結合の差異についてもクロマチン免疫沈降を用いて解析する。
またCD4-Creを用いたEed欠損では正の選択や負の選択と比較してアゴニスト選択がより強く障害されており、その機構解明に向けた実験にも着手する予定である。PRC2複合体がアクチン重合を制御しているとの報告があることから、胸腺DP細胞をTCRを介して刺激した際のアクチンの挙動を、野生型、Eed欠損、および細胞質型Eed発現マウス間で、フローサイトメーター、および蛍光顕微鏡を用いて解析する。また上記３系統間での分子生物学的および生化学的な比較を通して、細胞質でのEed量とTCRを介した正負様々な選択との相関についても検討し、胸腺DP細胞の選択時においてEedとTCRシグナルが互いをどのように制御しているのか明らかにする上での基礎的なデータを得る。またEedはインテグリンβ7と相互作用することが知られており、Eedによるインテグリンβ7を介した細胞接着能の制御についても検討する。
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| Causes of Carryover |
2月及び3月に計画していた実験がマウスの都合により遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰り越し分については、遅れた実験を行うことで使用する予定である。またその他については各種試薬･消耗品、マウスの購入、および学会参加費として使用する予定である。高額な機器類の購入は予定されていない。
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