2013 Fiscal Year Research-status Report
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25460606
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | 独立行政法人国立国際医療研究センター |
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Principal Investigator |
新田 剛 独立行政法人国立国際医療研究センター, 研究所, 室長 (30373343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 季之 独立行政法人国立国際医療研究センター, 研究所, 研究員 (10607328)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | T細胞 / シグナル伝達 / 胸腺 / 核 / Themis |
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| Research Abstract |
T細胞は獲得免疫システムの司令塔であり、その分化のしくみと機能の解明は免疫学における重要課題のひとつであるが、未熟T細胞（胸腺細胞）が抗原受容体（TCR）の抗原認識に従って正負の選択を受ける分子メカニズムの全容は未だ不明である。本研究では、胸腺細胞の正の選択を制御する動作原理の解明を目的とし、TCRシグナル下流で作用すると考えられる新規分子Themisの機能解析を行った。
正の選択を受ける前のCD4+CD8+ (DP)胸腺細胞においてThemisは核内でアダプター分子Grb2と結合しており、Themis欠損DP胸腺細胞では核内Grb2タンパク量が著しく減少することがわかった。また、Grb2はRNA結合タンパク質であるhnRNP Cと相互作用することがわかった。他のhnRNP分子や特定のRNAと結合する可能性についても現在検討中である。また、胸腺細胞の核内におけるGrb2の局在と相互作用タンパク質同定のため、FLAGエピトープタグを付加したGrb2ノックインマウスを、CRISPR/Cas9法を用いて作製中である。
Themisの核内機能を明らかにするため、核移行シグナル（NLS）の欠失変異体を発現するトランスジェニックマウスを作製した。NLS欠失変異体は核局在を失うとともに、Grb2との結合能およびTCRシグナルによるチロシンリン酸化能を失い、胸腺細胞の正の選択を誘導できないことがわかった。また、Themisは末梢T細胞によるIL-2産生に必須であるが、NLS欠失変異T細胞は正常なIL-2産生を示した。以上の結果より、Themisの核局在は胸腺細胞の正の選択に重要な役割を果たすが、末梢T細胞のIL-2産生には関与しないことが示され、Themisが胸腺と末梢で全く異なる機能を担うことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Themisの核移行シグナル（NLS）欠失変異体を発現するトランスジェニックマウスを複数ライン作製し、生化学的性状と胸腺細胞分化における表現型を明らかにすることができた。また、予想外の結果として、Themisによる末梢T細胞のIL-2産生においては、NLS依存的なThemisの核移行は必要がないことがわかった。NLS以外のThemis分子内ドメイン構造についても欠失変異体を発現するマウスを作製、解析し、各ドメイン構造に共通あるいは固有の役割を明らかにすることができた。
核内Grb2/Themis複合体の機能解析については、Themis- hnRNP C相互作用を明らかにできたものの、その分子機能や他のタンパク質との相互作用ネットワークを解明するには至らなかった。Grb2との核内相互作用タンパク質の同定を強力かつ網羅的に行うため、CRISPR/Cas9法を用いてGrb2-FLAGノックインマウスを作製するなど、対応を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Themisの核局在の意義を明らかにするため、NLS欠失に加え、外来NLSの付加または核外搬出シグナル（NES）付加変異体を発現するマウスを作製する。胸腺細胞の分化および末梢T細胞の活性化を指標として表現型を精査し、細胞質内と核内それぞれにおけるThemisの役割を解明する。また、Grb2をT細胞特異的に欠損するマウスを作製し、Grb2との相互作用がThemisの核移行に与える影響を検討する。
核内Grb2/Themis複合体の機能を明らかにするため、FLAG等のエピトープタグを付加したGrb2およびThemisノックインマウスを作製する。タグ抗体を用いた免疫沈降によって核内Grb2/Themis複合体を精製し、相互作用するタンパク質を質量分析によって同定する。また、RNAやゲノムDNAに結合する可能性についても検討する。Themisはヒストンメチル化酵素の一種PRTM6と結合することが示唆されているため、Themis分子内ドメインを欠失させた各種変異マウスを用いてPRTM6との相互作用の有無およびその様式を明らかにし、核内Grb2/Themis複合体によるヒストンメチル化を介したT細胞の運命制御の可能性を検証する。
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