2014 Fiscal Year Research-status Report
TMレジスタンス/FXa・ATレジスタンスによる血栓傾向の新規検出検査法の開発
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25460683
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
高木 明 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30135371)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小嶋 哲人 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40161913)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | プロトロンビン分子異常 / トロンボモジュリン抵抗性 / 血栓傾向 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
野生型ヒトプロトロンビンcDNAを鋳型として変異導入PCR法を用いて、トロンボモジュリンとの親和性に関連する部位およびその近傍のp.596Arg、p.540Thr、p.541Arg、p.599Lys、p.600Tyr部位に1塩基置換変異型ヒトプロトロンビンcDNAを作製し、野生型および各変異型プロトロンビンcDNAをそれぞれ哺乳動物細胞用の発現ベクターpcDNA3.1に組み込んだ。各発現ベクターをヒト胎児由来培養細胞株HEK293に遺伝子導入後、G418耐性およびウエスタンブロッティング解析により野生型および変異型プロトロンビン高発現HEK293細胞株クローンを樹立した。野生型および変異型プロトロンビンを各プロトロンビン高発現HEK293細胞株の培養液から濃縮した。培養液から濃縮したプロトロンビンの比活性が細胞株クローンにより異なることを見つけ、発現量の極めて高いクローンでは比活性が低い傾向であった。発現量が多すぎると翻訳後修飾が十分にできなくなってしまうと考え、比活性と発現量の両方の観点から高発現細胞株クローンを選択し直した。
野生型および変異型プロトロンビンを用いて、生理的プロトロンビンアクチベータ、生理的プロトロンビンアクチベータと作用機序が類似するOxyuranus scutellatus蛇毒由来プロトロンビンアクチベータによるプロトロンビン活性化法の至適条件をそれぞれの変異体について再確認した。
野生型、変異型プロトロンビンを至適条件下に活性化し生成されたトロンビンにトロンボモジュリンを加えて、経時的にトロンビン不活化動態をフィブリン形成能を指標に解析するTM抵抗性解析法を考案した。p.541変異体は野生型と同程度に不活化され、TM抵抗性を示さなかったが、p.596、p.540、p.599、p.600変異体はTMによる不活化に抵抗性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１アミノ酸が置換（多くは１塩基置換に由来）し、翻訳後修飾を十分に受けられる程度に発現する野生型・変異型プロトロンビン発現細胞株を樹立し、Gla領域が十分にカルボキシル化されたリコンビナントプロトロンビンを20種類程度作成できた。十分量が回収できなかったp.596Proは細胞内で処理され分泌されないことが判明し、p.596Pro血栓症の原因にはならないことが予想された。
作成した各変異型プロトロンビン由来トロンビンは予想通り生理的抗トロンビン分子・アンチトロンビンに抵抗性を示した。アンチトロンビン抵抗性はp.541変異体由来トロンビンでは軽度であったが、p.540、p.596、p.599変異体由来トロンビンは強いアンチトロンビン抵抗性を示した。p.600変異体由来トロンビンでは変異の種類により様々な程度のアンチトロンビン抵抗性を示した。
TMに結合したトロンビンはフィブリノゲン凝固能は低下するが発色性合成基質s-2238水解活性は低下せず、フィブリノゲン凝固能によってのみTM抵抗性が評価できることが判明した。今回設定したTM抵抗性解析法を用いると野生型、p.541変異体由来トロンビンでは約20%の残存トロンビン活性が残存したのに対し、p.540、p.596、p.599、p.600（一部）では40～60%のトロンビン活性が残存し、TM共存下においても正常トロンビンのようにフィブリノゲン凝固活性が低下せず、TM抵抗性が検出できた。静脈血栓塞栓症の発症リスク検査法となり得ることが予想された。
トロンビン・TM複合体によるプロテインC活性化能解析法を検討設定した。
活性化プロテインCの発色性合成基質測定の際に誤差となる残存トロンビンの影響は選択的抗トロンビン剤の添加により除外する方法を確立した。p.596変異体由来トロンビンではTM共存によるプロテインC活性化増強能は比較的保たれていた。
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| Strategy for Future Research Activity |
変異型トロンビンとTMとの反応性解析法として、TM固相化センサーチップを用いた分子間相互作用解析結果と比較し、開発したフィブリノゲン凝固能の変化をとらえるTM抵抗性解析法を評価する。
生理的にはアンチトロンビンにより不活化される凝固第X因子のアンチトロンビン抵抗性を示すことが予想される変異体p.Arg150Alaの翻訳後修飾が十分に受けられる程度に発現する安定発現細胞株を野生型安定発現細胞株とともに樹立する。血漿由来精製ヒト凝固第X因子を用いて、活性化、アンチトロンビンによる不活化、残存活性化第X因子測定による活性型凝固第X因子（F.Xa)のアンチトロンビン抵抗性検出法を検討・設定する。野生型および変異型凝固第X因子をそれぞれの安定発現細胞株培養液から調整し、樹立したF.Xaアンチトロンビン抵抗性検出法により評価する。
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