2014 Fiscal Year Research-status Report
動物接種とゲノム解析の組み合わせによる画期的な難同定病原微生物診断法の開発
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25460692
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
岡山 昭彦 宮崎大学, 医学部, 教授 (70204047)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 哲也 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (10173014)
高城 一郎 宮崎大学, 医学部, 講師 (20418841)
越本 知大 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (70295210)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 感染症 / 新規診断法 / レーザーマイクロダイセクション法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
感染症の診断と治療には病原微生物の同定が不可欠である。しかしグラム染色では菌体を確認できても培地に発育してこない場合や、複数の菌種が混在し目的の起炎菌を分離することが困難な場合がある。これらの問題を解決するため、検体の塗抹標本（グラム染色）から直接起炎菌と推測される菌体をレーザーマイクロダイセクション（LMD）で回収し遺伝子レベルで同定する方法と動物への検体接種を組み合わせることにより、病原体診断率の飛躍的向上を目指す。平成26年度においては、25年度において問題であった菌体の切り出しから核酸抽出、コンタミネーションをさけるLMD法による遺伝子診断法の確立を目指して研究を行った。コンタミネーションおよびキャリーオーバーの防止が最も重要と考えられ精製水を含む試薬、器具・道具、実験環境等について系統的な防止策を講じ、回収した菌体からアルカリ変性法でDNA抽出を行った後、PCRで細菌16S rRNA geneの増幅を行い、ダイレクトシーケンシング法で塩基配列を決定した。この方法により、大腸菌の塗抹染色標本をモデルとしてLMDで菌体を切り出し、DNA抽出を行い16S rRNA geneの増幅を行ったところ、サンプル中に100菌体以上認められれば再現性よく増幅産物を得ることができた。次年度においては、臨床応用を目指し、様々な条件下でDNA抽出法を検討し、少数菌体から高い効率で DNAを抽出する方法を確立する。また、大腸菌以外の菌種を用いた検討も行いながら、感染症モデルマウスや実際の臨床検体を用いて本法の有用性を確認したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LMD法により通常の細菌（大腸菌）について100個程度の菌体から目的とする細菌由来の遺伝子の検出が可能であった。またコンタミネーションを抑制することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
様々な条件下でDNA抽出法を検討し，少数菌体から高い効率で DNAを抽出する方法を確立する。また、大腸菌以外の菌種を対象とした検討を行う。感染症モデルマウスや実際の臨床検体を用いた本法の有用性の確認を行う。
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