慢性骨髄性白血病細胞を１細胞レベルまで検出可能な病態モニタリング技術開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460699
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 佐藤 恵理子 順天堂大学, 医学部, 准教授 (60398675)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小松 則夫 順天堂大学, 医学部, 教授 (50186798)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 慢性骨髄性白血病 / 病態モニタリング技術 / BCR/ABL融合点

Research Abstract

本研究課題では，ゲノムDNAからBCR配列をもつDNA断片のみを濃縮し，これを次世代シークエンサーによって網羅的に解析することで，従来の手法では不可能であったCMLの再発を予測可能なレベルまでBCR/ABL遺伝子量を定量可能な，新規モニタリング技術を開発することを目的とする。25年度はゲノムDNAからBCRの配列をもつDNA断片を特異的に濃縮する技術を確立することを目標とし，検討を行った。
まず，CML由来の細胞株（K562, TCC-S, KCL-22）よりゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型とし，BCR遺伝子のM-bcr領域（BCRエクソン12から15，およそ5 kbp）をPCRにより増幅した。電気泳動により目的のサイズにバンドがあることを確認した後，これを切り出して精製し，BCR配列濃縮用のプローブを作製するため，エンドヌクレアーゼによる酵素処理によってPCR産物を100～300 bpに断片化するための条件の最適化を行った。その後，決定された条件のもと，BCR配列を持つDNA断片を大量に獲得し，3'末端をビオチン化することで濃縮用プローブを作製した。
続いて，上記の3株の細胞ペレットを15%ホルマリンにて固定化し，パラフィン包埋法にてセルブロック化した。作製したブロックよりミクロトームを用いて薄片を切り出した。このとき，薄片の枚数，厚みを様々に変化させ，プローブに供試するに十分な量のゲノムDNAが得られる枚数・厚みを決定した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

25年度はゲノムDNAからBCRの配列をもつDNA断片を特異的に濃縮する技術を確立することを目標とした。本年度においてプローブの作製とパラフィン包埋サンプルからのゲノムDNAの抽出法を確定させることはできたが，プローブとゲノムDNAのハイブリダイズとそれに続く溶出の条件最適化には至らず，次年度へ検討を持ち越すこととなってしまった。しかしながら，この遅延は微々たるものであり，次年度にて取り返せるものと判断し，「（3）やや遅れている」との評価とした。

Strategy for Future Research Activity

25年度において，細胞株（K562, KCL-22, TCC-S）のパラフィン包埋サンプルからのDNA抽出法の最適化，プローブ作製に関する最適化を終えたので，26年度において，プローブにより回収されたDNAが, BCRの配列を持つもののみであることを確認するため, 以下の要領によりPCRによる増幅を試みる。
これまでの検討により，K562, KCL-22, TCC-S株のBCR/ABL breakpointは明らかとなっている。そこで，回収されたDNAを鋳型として，BCR/ABL融合点近傍をPCRにより増幅できるか確認する。また，9番，22番いずれの染色体上にも存在しないRNasePをネガティブコントロールとし，これが回収されたDNAからは増幅されないことを確認する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

25年度の実験進捗の遅延のため，差額が発生してしまった。しかしながら，この遅延は次年度にて修正できるレベルであるため，差額を次年度への繰り越しとした。
当初の計画通り，プローブとゲノムDNAとのハイブリダイズ条件，およびプローブと結合したゲノムDNAの溶出条件の最適化のため，繰越金を使用する。その他の予算についても，計画通りに使用する。