白血病新規マーカーとしての血清ユビキチン測定の有用性の検討

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460711
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Himeji Dokkyo University
• Principal Investigator: 炬口 真理子 姫路獨協大学, 薬学部, 准教授 (10379430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮本 和英 姫路獨協大学, 薬学部, 准教授 (10415317) ; 西郷 勝康 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (20304107) ; 谷口 泰造 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (70346253)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ユビキチン-プロテアソーム / プロテアソーム阻害剤 / PML/RARA

Research Abstract

本研究は、ユビキチン-プロテアソーム系（UPS）に関わる酵素、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)及びユビキチンリガーゼ(E3)のうちE2活性が、白血病のバイオマーカーとして臨床検査に適応可能かどうかを検討するものである。
E1、E2、E3は蛋白質固有であり、急性前骨髄性白血病(APL)に特徴的なPML/RARAキメラ蛋白のE2がUbcH8、E3がSIAH-1であるという報告（FASEB J. 2008）を前提に、APL細胞株NB4を用いて実験を行なった。UbcH8がNB4細胞中に微量に存在し、培養上清中には存在しないことをIP（免疫沈降）法にて確認後、NB4にプロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ: BTZ）を添加したところ、BTZ 濃度依存的に (1) NB4の細胞死が誘導され、 (2)細胞中のユビキチン化(Ub) - PML/RARAは増加、Ub- UbcH8は微量変化し、 (3)培養上清中のUb - PML/RARA、Ub - UbcH8は微量ではあるが検出された。一方、E3（SIAH-1）を人工的にペプチド合成し、生理活性反応測定装置（AMIS-101：バイオエックス社）を用いて、NB4培養上清中のE2活性を測定したところ、BTZ 濃度依存的にE2活性は増加した。
生理活性測定装置における結果は、申請者らの仮説「UPSで処理されずに蓄積した蛋白がERストレスを高めてUnfolded protein response (UPR)を破綻させ、細胞死を誘導する。さらに細胞死の結果、細胞内からUPS関連物質が細胞外に逸脱し、その逸脱物質はUPS関連疾患の病態を反映するバイオマーカーとして使用できる」が、培養細胞レベルで実証されたことを意味する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

IP-WB（ウエスタンブロット）法によるUbch8（E2）蛋白の検出は、NB4培養上清中において極微量であるため、使用抗体・WB測定条件等の変更に時間が費やされ、やや遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

生理活性反応測定装置によるE2活性の測定は、人工的に作製したE3（SIAH-1）を用いてE2からE3に転送されるプロトンの変化を検出するものであり、E2非選択的にE2活性が測定される。申請者らは、E3（SIAH-1）に対するE2がUbch8、Ubch5、Ubch6など数種類あることを報告している（J Pept Sci. 2012）。また、BTZを添加した培養上清では、E2活性は増加するが、E2量が変化していないことから、E3（SIAH-1）をユビキチン化するUbch8以外のE2が存在することが示唆され、そのE2を探索し、特定する。更に、APL担癌マウスの血清中及びAPL患者の血清中のE2活性を測定しする計画である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

実験がやや遅れているため
研究費の大部分は試薬などの消耗品に使用する予定であり、本年度購入を見送ったデータ解析用のパーソナルコンピュータを購入する予定である。