2013 Fiscal Year Research-status Report
次世代シークエンサーを用いた死後microRNAの網羅的検索とその法医学的応用
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25460860
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
橋谷田 真樹 関西医科大学, 医学部, 講師 (40374938)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | microRNA / ラット / 死後経過時間 |
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| Research Abstract |
ノンコードRNAであるmicroRNA（miRNA）は，約20塩基の非常に短い一本鎖RNAであるが，遺伝子発現を制御する機能を持ち，高次生命現象や病態への関与が注目されている．短いがゆえに死後も体内に残存することがこれまでの実験で確認されており，法医実務に有効なバイオマーカーとなりえる可能性を持つ．本年度は，ラットを用いて死後経過時間と死後残存するmiRNA の相関を観察し，死後経過時間推定のマーカーとしてのmiRNA確立を目的とした．
実験方法としては，週齢10週のSDラット18匹（平均重量439g）を過剰麻酔で安楽死させ，その直後から死後72時間までの間を0h,12h,24h,36h,48h,72hの3匹6群に分けた．それぞれのラットの心臓および肝臓を試料とし，市販のRNA抽出キットを用いてトータルRNAを抽出した．これまでの研究結果で死後も安定して残存しているmiR-16，miR-21を内在性コントロールとして選択し，ターゲットを6種のmiRNA（Let-7d*, miR-207, miR-346, miR-758, miR-872*, miR-346）,およびU6snRNAとした．TaqMan microRNA Assay法により検討した結果，心臓ではmiR-16が，また肝臓ではmiR-21がそれぞれ死後も安定して一定の残量を示したことからこれを内在性コントロールとした．7種のターゲットの解析結果は，いずれもU6snRNAをターゲットとしたものが最も相関関係がよく，それぞれの相関係数は心臓（コントロールmiR-16）でR2=0.8814，肝臓（コントロールmiR-21）でR2=0.6088を示した．U6snRNAはmiRNAではないが，逆に106塩基とある程度の長さを持ち，死後経過時間とともに適度に分解されていくことが，相関を良くした理由であると推察される．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラットの死後におけるmicroRNA(miRNA)はまだまだ未知の部分が多く，各主要臓器にその残存が確認されているのみである．最終的な目的は，死後も観察できるストレスマーカーの確立であるが，生前のストレス状態を反映するmiRNAを発見する前に，これまでの我々の研究成果をもとにもう一つの法医学的応用，すなわち死後経過時間推定としての利用を試みたわけである．その結果，死後安定なmiRNAを内在性のコントロールとし，ある程度の長さをもつRNAをターゲットとすることでより正確な死後経過時間推定への道筋ができた，世界的に見てもこのようなmiRNAの応用例は見当たらず，十分評価されるべきものであると言える．死後のmiRNAの挙動を検索するすることで，少しずつではあるが最終的な目的へ到達可能であると思われることから，この研究課題は，おおむね順調に進展していると言える．
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| Strategy for Future Research Activity |
死後経過時間の推定マーカーとしてのラットmiRNA研究は，次のステップとして血液を試料とすることを考えている．臓器より比較的容易に採取でき，全身を循環していることから個体全身の状態を均一に反映しているからである．死後48時間までを細かく区切り，さらに，適度な長さを持つ他のmessenger RNA(mRNA)などもターゲットに含めることで，より正確な死後経過時間推定マーカーの確立を目指す．生前のストレスマーカーとしてのmiRNAについては，ラットにアルコールを投与したのち運動させ，水袋で全身を圧迫するなどしてストレスを与え，その後安楽死させてからのmiRNAについて網羅的に検索することを予定している．これは実際に発生した法医学的事例をそのままラットでモデル化したものである．この事例では剖検でも死因を特定するのが非常に困難であったようであり，このような場合に，生前のストレス度合いを死後でも評価できるマーカーが存在すれば，法医学的に非常に有用であろうことは容易に想像がつく．しかし，ストレスと死後miRNAについてはまだまだ情報が不足していることから，次年度は次世代シークエンサー等を利用して網羅的な検索が必要となるであろう．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究申請時には東北大に所属していたが，平成25年度初頭に平成26年1月から関西医科大学に異動することが決定した．そのため年間を通しての研究計画に若干の変更が生じ，研究費の使用が滞ったのである．すなわち，東北大が所持している次世代シークエンサーの使用予定を変更せざるを得ず，その分の予算を消化できなかったため，未使用の予算が繰り越しとなり，次年度使用額が0ではなくなったのである．
東北大学医学系研究科の非常勤講師としての身分が確定したことから，要北大学法医学分野と共同研究を行うこととした．その結果，東北大が所持している次世代シークエンサーのし使用を考慮に入れて，実験計画を立案中である，もし，東北大の次世代シークエンサーを使用できなくとも，外注検査することによりラットmiRNAの網羅的解析は可能である．
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