HRM解析による法医学に有用なSNPマルチゲノタイピング法の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460868
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 中川 真由美 鳥取大学, 医学部, 講師 (00243410)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: HRM解析 / SNP / マルチプレックス解析

Research Abstract

法医学分野におけるDNA鑑定では高度に変性・分解した試料も多く、変性に対し抵抗性を示す一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism :SNP)はその解析に適している。自然災害の増加により多くの犠牲者が出る可能性もあり、多数のそれも変性した微量の試料を迅速に鑑定できる方法の開発が望まれる。本研究ではリアルタイムPCR装置を用いたHRM(High Resolution Melting)解析によるSNPのマルチゲノタイピング法の確立を目指す。
対象とする遺伝子領域は、法医学分野でも多型マーカーとして用いられているABO血液型遺伝子の3ヶ所のSNPと、そのほか3部位を選択した。まず試料DNAの収集と、ABO血液型遺伝子の3ヶ所のSNPの解析・確認をAPLP法により行った。また、他のSNP部位についても従来法で解析を行った。HRM解析によるSNPタイピング法には①プローブを用いない方法と、②いずれか一方のアリルに特異的なプローブを一種用いる方法がある。まず①の方法によるABO遺伝子の解析法を確立することを目指した。すでに報告されている論文を参考に、アリル特異的プライマーを準備し、かつ増幅産物の長さに差が生じるようそれぞれのプライマーの5’末端に長さの異なる配列を付加した。ここまではAPLP法の原理とも同じである。論文では増幅産物の長さを変えることでTm値が異なり融解曲線に差が生じると述べてある。このプライマーによるHRM解析を行ったが、アリルごとの融解曲線の区別が難しいため、プライマー設計および解析条件について検討を重ねている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ABO血液型遺伝子のSNPについてHRM解析を行った結果、アリルごとの融解曲線を判定することが難しく、また再現性においてもまだまだ改善の余地がある。はっきりと正確に判定できるよう改良していきたいと考える。

Strategy for Future Research Activity

良好な結果は得られていないが、少しずつ改善されてきている。さらに他の論文などを集め知識を集約し、さまざまな面から工夫を重ねて解析法を確立したいと考えている。