RNA結合蛋白を介した上皮間葉転換制御による抗癌剤耐性克服療法の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25460921
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小林 隆彦 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80333607)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小松 嘉人 北海道大学, 大学病院, 准教授 (60333598)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 抗癌剤耐性

Outline of Annual Research Achievements

消化器癌は造血器腫瘍や生殖器癌に比較して化学療法の奏効率は低く、多剤併用による強力な化学療法を行っても、進行癌においては未だに予後不良である。癌化学療法の問題点の一つに、治療により薬剤耐性細胞が出現し、再増殖を来すことがあげられる。そのため抗癌剤への感受性や耐性に関する分子機構の解明は非常に重要である。近年、上皮細胞が間葉系細胞に形態変化する現象である上皮間葉転換（Epithelial-Mesenchymal Transition：EMT)が、癌細胞の浸潤能亢進、抗癌剤耐性獲得などに関連していることが報告されているが、その機序は不明な点が多い。
遺伝情報の発現は、DNAから蛋白質までの様々な段階で複雑に制御されている。RNA結合蛋白質(RBP)は、mRNAのスプライシング、核外輸送、細胞質内局在、安定性及び翻訳効率の調節などの転写後遺伝子発現調節において重要な働きをしている。申請者らはRNA結合蛋白RBM5が、癌抑制遺伝子p53の転写活性を亢進させることを報告した。さらに各種の癌細胞、癌組織においてRBM5の発現が低下していることを見出した。また、RBM5は癌細胞に対して、5-FUなどの各種抗癌剤の感受性を高めることも解明した。
現在、RBM5の発現量により変動するRBM5下流遺伝子群の解析およびRBM5結合遺伝子を網羅的に解析し、癌細胞内での機能解析が進行中である。
これまでに、抗癌剤投与中の癌細胞において、RBM5が発現により変動するEMT制御遺伝子を網羅的に解析を行った。その中で新規のEMT制御遺伝子あるいは抗癌剤感耐性制御遺伝子有望なものを詳細に検討し、抗癌剤耐性克服への応用を目指していく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

RBM5に結合するmRNAをRNA-結合タンパク質免疫沈降法を実施し、胃癌細胞からRBM5に特異的に結合するmRNAを回収している。しかし ながらRBM5に結合しているRNAは非常に微量であり、mRNAそのものが不安定であり、定量・定性の検討が非常に困難であり、再現性の 検討を慎重に行っている。 またマイクロアレイによって拾い上げた幾つかの候補遺伝子が、１つの胃癌細胞株に特異的なものか、他の消化器癌細胞にも機能している普遍的なのかの見極めは簡単では ない。また一方で、これらの候補遺伝子がRBM5に特異的に作用しているのかを慎重に検討している。癌細胞において、EMTが抗癌剤による抗腫瘍効果に与える影響は、抗癌剤により様々であり、いくつかの抗癌剤に絞る必要性があることが判明した。また癌細胞の種類によっても影響度は様々であるため、普遍的な抗癌剤耐性機序に関わる分子の拾い上げは、予想以上に複雑であった。
またEMTそのものが、複雑な機序で制御されており、EMT誘導因子、阻害因子の影響も単純ではないため、結果の解釈に時間を要している。
いくつかの候補遺伝子は、RBM5によりその発現制御を受けていることが判明してきているが、RBM5による直接的な制御の可能性と、他の分子を介した間接的な制御の可能性もあり、その評価は単純ではないことが分かってきた。今後はこれらの未解決部分を一つ一つ解析していきたい。

Strategy for Future Research Activity

現在は抗癌剤の中から消化器癌に頻用される、代表的な抗癌剤として5-FUおよびCDDPに絞り込み、胃癌細胞内における抗癌剤耐性機序の検討を行ってい る。また抗癌剤に対する特異性を検討するために、抗癌剤の投与時間依存性、投与量依存性を示す変動遺伝子に候補を絞り込み、細胞生物学的な検討を行っていく予定である。
現在、データマイニングのアルゴリズムを改善させ、複数回のマイクロアレイに共通する変動遺伝子の抽出をさらに厳格に絞り込んでいる。また一方で、EMT関連遺伝子および抗癌剤耐性に関連するパスウェイ以外にも、転移、細胞増殖、細胞分化など、癌細胞の悪性度、増殖能に関連するようなパスウェイにおける候補遺伝子の拾い上げを行っている。この過程で、複数のパスウェイに関与する候補遺伝子は、癌細胞の特性に強く関与することが予想され、その分子の発現制御は抗癌剤治療の効果に大きな影響を与える可能性があると期待される。
これらのことより、データマイニングの手法の改善は非常に重要である。また今後は、候補遺伝子のDNAの構造解析を行い、類似分子の拾い上げを行い、細胞内における複雑なEMT制御機構の解析を行っていく予定である。

Causes of Carryover

繰り返し行われるマイクロアレイから抽出される膨大な数の変動遺伝子の中から、本研究に有用な遺伝子を拾い上げるには、厳格なデータマイニングのアルゴリズムが必要である。また候補遺伝子の顔細胞内のバリアントを比較検討するには、アライメント機能に優れた遺伝子解析ソフトが必要である。
今年度は他の実験試薬などの購入を優先させために、残額のみにてこれらの遺伝子解析ソフトを購入することができなくなったため、次年度に遂行するよう実験計画を修正した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

これらの遺伝子解析ソフトは非常に高価である。このため最終年度の交付金と合わせて、これらの解析ソフトを複数購入して、解析を進めていきたい。
またこれらの結果を踏まえて、より詳細な解析を行うために、種々の抗癌剤投与時の条件下における、候補遺伝子の変動解析を高速シークエンサーを用いて、バリアントの変動も含めて検討していきたい。
最終段階としては、候補遺伝子の細胞内機能解析、さらには実験動物における機能解析に発展させていきたいと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Serum HER2 levels and HER2 status in tumor cells in advanced gastric cancer patients (2015)
  • Author(s): Sasaki T, Fuse N, Kuwata T, Nomura S, Kaneko K, Doi T, Yoshino T, Asano H, Ochiai A, Komatsu Y, Sakamoto N, Ohtsu A
  • Journal Title: Jpn. J. Clin. Oncol Volume: 45 Pages: 43-48
  • DOI: 10.1093/jjco/hyu174
  • Peer Reviewed