2015 Fiscal Year Research-status Report
食道上皮に存在する酸感受性機械受容体イオンチャネルの機能解析
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25460931
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
神谷 武 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10254301)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20326135)
鹿野 美千子 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70405190)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 酸感受性機械受容チャネル / ASIC5 / マウス食道上皮 / RT-PCR / HEK293T細胞 / ウエスタンブロット |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食道上皮における酸感受性の機械受容チャネルの発現とその局在を明らかにすることを目的に研究を継続中である。食道上皮での酸感受性の機械受容チャネルについて、多数の候補について網羅的解析をすすめていたが、昨年度よりこの中で食道上皮での発現がほぼ確認されたASIC5に対象をしぼり、研究をすすめた。マウス食道のASIC5をクローニングするために行ったRT-PCRでは、マウス食道には2つのスプライシングバリアントが存在することが示唆された。さらにASIC5の様々な領域の遺伝子断片の発現を食道の部位別に比較すると、その断片も食道中、下部で発現が多いことがわかった。さらにウエスタンブロットにおいても、PCRと同様の結果を得た。一方、この市販抗体の特異性を別角度から検討し、様々なASIC5のコンストラクトを作製し、これをHEK293T細胞に強制発現させたサンプルをもちいたウエスタンブロット解析も並行して行ったところ、mRNAはきちんと発現しているにもかかわらず、タンパクレベルでは予想と反した結果が得られた。
現在この原因を調べているが、食道ではASIC5とともに、ASIC5に類似した塩基配列をもつ別の遺伝子が発現して機能している可能性も示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
RT-PCR、免疫組織化学的解析ではマウス食道でのASIC5の発現が十分示唆されていたが、様々なASIC5のコンストラクトをHEK293T細胞に強制発現させたサンプルをもちいたウエスタンブロット解析では、mRNAはきちんと発現しているにもかかわらず、タンパクレベルでは発現は確認できなかった。複数の市販抗体を試してみたが、いずれの場合もこれら既存の抗体が正しくASIC5を認識していないという結果であった。
このため、独自にASIC5抗原となるペプチドを設計し、ASIC5に対する抗体を作製し、この抗体を用いて同様の解析を行ったが、新たに作製した抗体も機能しなかった。このため現在計画に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ASIC5を認識する新たなよい抗体が作製できなかったが、RT-PCRではASIC5をコードする塩基配列の遺伝子断片がマウス食道の中、下部に豊富に発現することが分かったので、これをもとにこのｍRNAから転写翻訳されるタンパクを同定することを今後の課題としたいと考えている。
共同研究を行っている機能組織学教室で作製し、すでに保有しているASIC4ノックインマウスと同じプロトコールでASIC5ノックインマウスの作製をすすめていく予定である。同時にこのASIC4ノックインマウスを用いて、消化管（食道、胃、十二指腸、小腸、大腸）でのASIC4の発現も調べ、発現様式に特徴が見つかれば、そこから機能解析に発展させていく。
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| Causes of Carryover |
ASIC5に対する適した市販抗体がみつからず、新たに作製した抗体も機能しないという予定外の事態がおこり、その過程で免疫組織化学染色、ウエスタンブロットによる確認作業の回数が重なり、研究が止まってしまったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
共同研究を行っている機能組織学教室で作製し、すでに保有しているASIC4ノックインマウスと同じプロトコールでASIC5ノックインマウスの作製をすすめていく。同時にこのASIC4ノックインマウスを用いて、消化管（食道、胃、十二指腸、小腸、大腸）でのASIC4の発現も調べ、発現様式に特徴が見つかれば、そこから機能解析に発展させていく。経費はマウス作製、機能解析に際しての試薬、抗体の購入と、成果公表の学会旅費等に使用する予定である。
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