2013 Fiscal Year Research-status Report
NASHの病態におけるNrf2とミトコンドリア異常の関与メカニズムの解明
Project/Area Number |
25460983
|
Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
Research Institution | Niigata University |
Principal Investigator |
川合 弘一 新潟大学, 医歯学系, 助教 (80419291)
|
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須田 剛士 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (10361916)
|
Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
Keywords | NASH / NAFLD / ミトコンドリアDNA / Nrf2 |
Research Abstract |
本研究は、NASH モデルマウスを用いて、NASH の病態進展に伴ったミトコンドリアDNA(mtDNA)量の変化に伴ったミトコンドリア酸化障害とNrf2発現量との関連を明らかにすることが目的である。現時点での進行状況を以下に示す。 1.モデルマウスの作成と臓器採取:非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、およびNAFLDに対する食事療法を想定した以下5群のモデルマウスを作成した。(1)メチオニン・コリン欠乏食(MCD)マウス:NASHモデル、6週齡からMCD食投与、(2)STAMマウス:NASH-肝細胞癌(HCC)モデル、生後間もなくストレプトゾトシンを投与して作成したNASHモデルでHCCを発癌する、(3)高脂肪食(HFD)マウス:NAFLDモデル、6週齡よりHFD投与、(4)DI(dietary intervention)マウス:食事介入モデル、6週齡からHFD投与、12週齡で通常食に変更、(5)コントロールマウス:通常食投与。STAMマウスは取り扱い業者で作成し、購入したが、他のモデルマウスは6週齡で購入、6、8、12、16週齡で屠殺し、肝、骨格筋、腹腔内脂肪などの臓器採取を完了した。その後、各臓器からDNAを抽出した。 2.リアルタイムPCRによるミトコンドリアDNA(mtDNA)と核DNA(nDNA)の絶対定量:マウスのmtDNA上の遺伝子であるND1と、nDNA上の遺伝子であるβ-アクチンをクローニングし、プラスミドを調整した。TaqmanプローブによるリアルタイムPCRで、各プラスミドの希釈系列を用いて検量線を作成し、ND1とβ-アクチンのコピー数、すなわちmtDNAとnDNAのコピー数の絶対定量を現在行っている。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、まずは比較的多数のモデルマウス作成が必要だったが、本学動物実験施設の改修工事に伴い、マウスの購入・飼育開始時期が遅れたため、全体的に進行が遅れた。
|
Strategy for Future Research Activity |
1.間もなく、mtDNAとnDNAのコピー数定量が終了する予定である。終了後、直ちに解析を行い、NASH/NAFLDの病態進行に伴ったmtDNAのコピー数変化を評価する。 2.各モデルマウスよりRNA抽出、cDNA合成を行い、Nrf2を含めたmtDNAのコピー数コントロールに関わる遺伝子群の発現定量を行う予定である。 3.DNA酸化障害の評価目的に、肝から抽出したDNAサンプルをhOGG1の処理後にリアルタイムPCRを行い、未処理検体と比較する。PCR効率の差により、DNA酸化障害の評価が可能である。 4.肝のホルマリン固定標本を用いて、8-OHdGとNrf2の免疫染色を行う。
|
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
実験進行の遅れより、当該年度中に免疫組織染色用の抗体や、免疫染色キットなどが未購入なため、次年度使用額が生じた。 免疫染色用の抗体は使用期限があるため、具体的な実験開始時期が確定してから、次年度中には購入予定である。
|