2014 Fiscal Year Research-status Report
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25461000
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
加藤 正樹 九州大学, 大学病院, 助教 (60444808)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古藤 和浩 九州大学, 大学病院, 講師 (80289579)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 低酸素 / 慢性肝炎 / 肝硬変 / 肝線維化 / 肝発癌 / 類洞血流 / 末梢血単核球 / 定量的PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チオアセトアミド水による慢性肝障害ラットモデルを作成し、類洞血流の低下と肝実質の低酸素化を前年度に確認した。肝線維化の中心的役割を担う肝星細胞は、その大半が活性化された状態として線維性架橋に存在していた。近年、hedgehogシグナル系が肝星細胞の活性化制御に大きく関与していることが報告された。星細胞の静止状態の維持に必要なIndian hedgehogは、非活性化星細胞に恒常的に発現しているのに対し、活性化星細胞では発現が認められないか高度に低下していた。一方、Sonic hedgehogは対照群ではほとんど発現を認めないのに対し、チオアセトアミド投与群では一部の門脈域に陽性細胞を認め、CK19およびOV6と共発現していることから、肝前駆細胞に発現していると考えられた。
慢性肝障害患者の末梢単核球を用いた低酸素マーカーの確立のために、患者標本の収集を行いながら、一部に解析を開始した。慢性肝疾患症例28例から標本を収集した。背景肝疾患はHBV8例、HCV11例、NAFLD4例、その他5例。健常者は6例。健常者における発現レベルを１と規定すると、健常者と慢性肝疾患患者における各遺伝子の発現レベルは、HIF-1；1±0.85、1.94±3.91 (p=0.632)、HO-1；1±0.16、2.11±1.68 (p=0.018)、VEGF；1±0.42、2.94±2.30 (p=0.0023)、TNFα；1±0.34、1.35±0.62 (p=0.249)、IL-6；1±0.03、2.57±2.07 (p=0.067)、MCP-1；1±0.86、14.14±29.04 (p=0.044)、TGFβ；1±0.23、0.79±0.18 (p=0.078)、SOD2；1±0.37、1.02±0.45 (p=1)、カタラーゼ；1±0.36、1.20±0.42 (p=0.417)であった。慢性肝疾患症例におけるHO-1とVEGFの発現レベルは正に相関していた(R2 0.733、p＜0.001)。この結果からは、慢性肝疾患患者の末梢血単核球は、HO-1やVEGFなどの低酸素マーカーの発現が亢進していることが示され、肝内の低酸素レベルを反映していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
私たちが確立した、TRITCデキストラン静脈内投与による門脈血流障害評価法を慢性肝障害モデルでも応用することができた。ピモニダゾールによる肝内低酸素状態の評価もこの実験モデルに応用することが可能であり、慢性肝障害に伴い進行する肝内の微小血流障害により、早期より肝局所に低酸素状態が出現することが確認できた。重要な点は、低酸素状態が生じた肝実質内に存在する活性化肝星細胞には、Indian hedgehogシグナル伝達経路の発現抑制が認められたことである。肝星細胞は肝内環境の様々なストレスに応じて活性化され、コラーゲン等の線維成分を合成・分泌することにより肝線維化を促進し、最終的に肝硬変に導く。私たちの研究結果により、慢性肝障害で早期より生じる低酸素状態が、Indian hedgehogの発現抑制を介して肝星細胞を活性化し、肝硬変への進展を増強している可能性が示された。
慢性肝疾患患者の末梢血単核球の標本収集は、当初100例を目標としている。現在そのうち42例について収集することができている。うち28例に関しては、試験的に低酸素マーカーや、酸化ストレスマーカーのmRNA発現を評価することができた。この結果、慢性肝障害群ではコントロール群と比較して、HO-1やVEGFなどの低酸素マーカーの発現が増強していた。一方、低酸素の出現に伴い酸化ストレス応答遺伝子群の発現が亢進することが予想されていたが、慢性肝障害群とコントロール群では有意差を認めなかった。しかし、最終的な結論に至るにはまだ予定症例数の半分以下であり、さらに症例数を増して解析することが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラット慢性肝障害モデルで線維化の進行とともに認められた、蛍光デキストランで描出される血流障害領域やピモニダゾール染色で描出される低酸素領域の局在に一致して、発癌メカニズムに関与する因子である、抗アポトーシス作用を有するBcl-xL（低酸素状態で誘導される）、アポトーシスを惹起するBNIP3（低酸素で誘導される）、癌抑制遺伝子であるp16INK4A（肝硬変や肝癌では発現が低下する）、老化に関与するP21WAF1/CIP1（肝硬変では発現が増大するが、肝癌では低下する）の免疫染色を行い、血流障害や低酸素領域における発現レベルの変化を解析する。
慢性肝障害患者の末梢血単核球より抽出したRNA標本の収集をさらに進める。これまでに収集した標本はその多くが慢性肝炎の状態、或はChildAの比較的線維化の進行していない症例が中心であった。今後、ChildBやChildCなどの線維化進行例での標本を収集し、線維化の進行と同時に低酸素マーカーの発現が増強しているのか検討する。低酸素マーカーとしては、HO-1やVEGFに加えて、低酸素誘導因子であるHIF-1、HIF-2、アドレノメデュリン（ADM）等も測定し、また、酸化ストレス応答遺伝子としてグルタチオンペルオキシダーゼなども加えて解析を行う。これらのmRNA発現レベルの評価を行いながら、線維化指標であるFIB-4値との相関関係を統計学的に解析していき、線維化の進行と末梢血単核球における低酸素マーカーの関連性を確実なものにしていきたい。
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| Causes of Carryover |
物品費として使用する予定であったが、実験スケジュールの都合で軽微な残余が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度分の物品費として使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
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[Presentation] 末梢血単核球を用いた、慢性肝疾患症例の低酸素ストレスレベルの評価の可能性2014
Author(s)
田中紘介, 田中正剛, 真崎由子, 山崎晃裕, 原田林, 梅野成大, 加藤 正樹, 遠城寺宗近, 中牟田誠, 古藤 和浩, 髙栁 涼一
Organizer
第50回日本肝臓学会総会
Place of Presentation
東京
Year and Date
2014-05-29 – 2014-05-30
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