脂肪肝炎における脂肪化肝細胞の免疫原性及び肝内浸潤制御性T細胞についての検討

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461005
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 山口 寛二 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50381950)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 脂肪肝炎 / 免疫老化 / 獲得免疫 / PD-1

Research Abstract

脂肪肝炎の背景に免疫老化現象があることをマウス脂肪肝、脂肪肝炎モデルで確認するために、マウス肝内浸潤T細胞のFACS解析を行った。具体的には、B6マウス45匹を3群に分け、普通食、高脂肪食、高脂肪高コレステロール食を投与し、投与後8週間、16週間、24週間で各3匹ずつ、肝臓を還流処置で脱血後に処理して肝内浸潤T細胞、NKT細胞、クッパー細胞を単離し、それぞれのマーカー（CD3,CD4, CD8, NK1.1, CD1d, CD11c,F4/80)およびT細胞の制御性マーカーであるPD-1. CTLA4, LAG3, CD25/foxp3でFACS解析を行った。結果、老化および脂肪化で肝内浸潤T細胞に発現する制御性マーカーの継時的な上昇が確認された。老化に伴う変化を脂肪化が助長していると考えられた。また、同時に末梢血、脾臓内のT細胞も単離し、肝臓での所見と比較検討を行った。脾臓でも肝臓と同様の傾向が確認されたが肝臓ほどの強い変化ではなかった。一方、末梢血ではほとんど変化がなく、肝内浸潤T細胞の変化を末梢血で予想することは困難であると結論した。次に、各6匹の残ったマウスより血液、肝臓をサンプル採取し、解析を行った。肝臓よりmRNAを抽出し、リアルタイムPCRで炎症性サイトカイン、ケモカインについて遺伝子発現解析を行ったところ、炎症の程度に応じてPD-1の発現が高い傾向があったが、同時にリガンドであるPDL-1の発現も上昇していた。さらに、得られた肝臓のパラフィンブロックからPD-1, LAG3の免疫染色を施行したところ、肝内浸潤リンパ球の一部にPD-1陽性細胞が確認されたが、その局在に関しては各群で有意な差はなかった。今後は、脂肪肝炎におけるPD-1発現の意義を検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の達成目的である、脂肪化と老化による肝内浸潤T細胞における制御性マーカーの発現は継時的に追うことができた。当初は制御性T細胞のマーカーとしてCD25を挙げていたが、マウスのCD25の免疫染色およびFACS解析は比較的困難であることが判明し、細胞内転写因子であるFoxp3を染色し直すことで判断できたが、予定より時間を要した。また、単離後のT細胞を刺激下で培養し、細胞内サイトカインを測定することで、制御性マーカーを発現したT細胞の表現型を解析したところ、PD-1陽性、LAG3陽性CD8, CD4細胞においてはその獲得免疫能の低下はあまり見られなかった。細胞内サイトカインの染色に関する刺激薬剤の最適条件決定に時間を要したが、一定の条件を決定し安定して施行できるようになった。

Strategy for Future Research Activity

当初の今後の予定である、免疫老化による獲得免疫異常が肝炎に関与すること、そして獲得免疫のターゲット抗原としては、脂肪化した肝細胞に免疫原性があることの検討を行う。
免疫老化に伴う、肝内浸潤Ｔ細胞に制御性マーカーが発現することで、Ｔ細胞機能低下が予想されるが、これまでの報告では、CD4 陽性Ｔ細胞にPD-1 が発現すると炎症性サイトカイン、オステオポンチンを高発現するという報告があり(Shimatani K, et al. 2009 PNAS)、制御性Ｔ細胞が関与する獲得免疫異常が予想されるため、脂肪肝炎での制御性Ｔ細胞と肝炎の関連をPD-1 シグナル阻害モデルを作成し明らかにする。また、非特異的な制御性Ｔ細胞の発現だけでなく、脂肪化、肥大化肝細胞が免疫原性を獲得し抗原特異的な肝炎を惹起する可能性を明らかにすべく、ヒト肝生検検体でも制御性T 細胞の発現に同様の傾向がみられた場合は、マウスだけでなくヒト脂肪肝炎患者の血清中からすでにコマーシャルベースとなっている抗体アレイ法を用いて、特異抗原の候補を検索し、脂肪化肝細胞に特異的な抗原の検索を行う。