2013 Fiscal Year Research-status Report
血管内皮細胞による内因性線溶活性発現増強機構の解明とその応用による血栓症予防
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25461123
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
鈴木 優子 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (20345812)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浦野 哲盟 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50193967)
佐野 秀人 浜松医科大学, 医学部, 助教 (80623842)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 血管内皮細胞 / 線溶活性 / 組織型プラスミノゲンアクチベーター / 蛍光顕微鏡 / 可視化解析 / 糖鎖 |
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| Research Abstract |
血管内線溶活性の開始因子である組織型プラスミノゲンアクチベーター（tPA）は血管内皮細胞から分泌される。これまでに培養血管内皮細胞を用いてGFP融合tPA（tPA-GFP）の分泌過程をリアルタイムに可視化することにより、分泌後のtPAは細胞表面に滞留して効果的にtPA活性を発現し、細胞上に作成したフィブリンの分解を促進することを明らかにしてきた。
本研究において内因性線溶活性発現増強機構を解明するにあたり、平成25年度はtPAの滞留要因をさらに詳細に検討することを目的とした。予備実験として糖鎖結合タンパク質のレクチンファミリーに属しガラクトースに対して結合特異性を有するガレクチン1がtPA分泌顆粒に共局在することが明らかになったことから、糖鎖結合部位変異tPA-GFP発現ベクターを作成しその特性を検証した。tPAの4箇所の糖鎖結合部位（T61, N117, N184, N448）をそれぞれをN, Q, Q, Qに置換した糖鎖非結合tPA（TATNQ-tPA）-GFPでは、予想に反して分泌顆粒開口後の細胞表面滞留量が野生型に比し増大した。また細胞上に作成したフィブリン塊の溶解は野生型に比しTATNQ-tPA-GFPでは遅延傾向を示したが、変異によるtPA活性の変化かあるいは発現量の差違によるものであるかは明らかでなかった。これらの結果から、tPAの糖鎖を介したガレクチン1への結合がtPAの滞留に関与する可能性は低いと考えられた。また効率的なフィブリンの溶解には、tPAの細胞表面から解離も必要である可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
tPAの細胞表面結合要因として糖鎖の関与が否定的であったことを受け、別の要因をさらに検討中であり、新規結合責任要因が解明できつつあることから、上記区分評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
tPAの細胞表面結合要因として新たに判明してきたことをさらに確証づけ、より効果的な細胞表面線溶活性発現のメカニズムを血漿あるいは流速存在下も含めさらに明らかにする。
ただし細胞膜近傍のみの蛍光検出に有用な全反射蛍光顕微鏡において、現時点では1レーザ励起、2波長測光により緑色および赤色蛍光の検出をしているが、赤色蛍光の検出が困難であるため、今後レーザならびにコンバイナ-の追加設置等が必要になる可能性がある。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品での必要額が計画した額よりも少額であった。
次年度は顕微鏡周辺機器の購入も考慮しており、次年度使用額とあわせ必要となる見込みである。
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