2014 Fiscal Year Research-status Report
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25461253
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
武藤 重明 自治医科大学, 医学部, 教授 (40190855)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | claudin-8 / 腎集合管 / タイトジャンクション / 細胞間短絡路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、集合管に発現しているclaudin-8の水・電解質輸送における役割を、claudin-8遺伝子欠損マウスとその野生型/ヘテロ型マウスを用いて検討した。以下にその結果を示す。
(1)tail-cuff法で測定した血圧や脈拍は、claudin-8遺伝子欠損マウスと野生型/ヘテロ型マウスで有意差を認めなかった。
(2)代謝ケージ内、飲水/食餌自由摂取下で2群のマウスを1日飼育し、metabolic balance studyを行った。体重は2群のマウスで有意差を示さなかった。1日当たりの尿量、便量、飲水量、食餌摂取量は、いずれも2群で不変であった。体重当たりの腎重量比も2群で有意差を認めなかった。また、血清クレアチニン濃度、Na濃度、K濃度、Ca濃度、Mg濃度、P濃度、クレアチニンクリアランス、尿中へのNa排泄率、K排泄率、Mg排泄率、P排泄率は、いずれも2群で不変であった。一方、尿中Ca排泄率は、欠損マウスで野生型/ヘテロ型マウスに比べ約2倍(p<0.05)に増加していた。以上より、claudin-8が腎臓のCa排泄に重要な役割を担っていることが示唆された。claudin-8を過剰発現させたイヌの腎遠位尿細管細胞株MDCK細胞では、Naイオンのような1価の陽イオンの透過性低下に加え、Caイオンのような2価の陽イオンの透過性も低下することから、claudin-8はMDCK細胞の細胞間短絡路で陽イオンのバリアを形成すると考えられている(J Biol Chem 278: 17350, 2003)。このMDCK細胞を用いた研究結果から、claudin-8の欠損で、1価や2価の陽イオンに対するバリアが解除され、細胞間短絡路の陽イオン透過性が亢進することが予想され、これが上記metabolic balance studyの結果とどのように関連するのか、今後の検討課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成25年度の途中から、claudin欠損マウスを供給している神戸大動物センター飼育室で病原微生物が検出され、claudin欠損マウスの搬送が不可能となり、claudin欠損マウスを用いた実験が一時中断したことによる。辛うじて、claudin-8遺伝子欠損マウスとその野生型/ヘテロ型マウスを用いた研究は、metabolic balance studyと血圧/脈拍測定を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
腎臓の血管内皮細胞のみに発現しているclaudin-15の水・電解質輸送における役割を、claudin-15遺伝子欠損マウスとその野生型/ヘテロ型マウスを用いて以下の方法で解明する。
(1)機能的解析
代謝ケージ内、飲水/食餌自由摂取下で2群のマウスを24時間飼育し、尿量、飲水量、食餌量、便量および血清と尿のクレアチニン濃度、Na濃度、Cl濃度、K濃度、Ca濃度、P濃度、Mg濃度、浸透圧を測定し、腎臓全体として水・電解質代謝異常がclaudin-15遺伝子欠損マウスに存在するのか評価する。尿浸透圧がclaudin-15遺伝子欠損マウスで低下していれば、さらに24時間または48時間絶飲水とし、尿量と尿浸透圧を2群で比較する。上記metabolic balance studyで、水・電解質代謝異常が出現したならば、腎尿細管の水・電解質輸送を担当している各種輸送体に対する抗体を用いてWestern blotを行い、蛋白発現量を比較する。さらに、左記抗体を用いて腎臓を染色し、どの尿細管分節に発現している輸送体に蛋白発現量の異常が存在するのか検討する。また、輸送体の蛋白発現量の異常を認めた尿細管分節を単離・灌流し、水や電解質の正味経上皮輸送量を2群で比較する。
(2)形態的解析
機能的解析でclaudin-15遺伝子欠損マウスに異常を認めた場合には、形態的解析を行う。2群のマウスの腎臓で、ヘマトキシリン-エオジン染色による光顕レベルの評価、claudin-15に対する抗体を用いた免疫組織染色による評価、超薄切片法やフリーズフラクチャー法による電顕レベルの評価を行う。
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| Causes of Carryover |
平成25年度の途中から、claudin欠損マウスを供給している神戸大動物センター飼育室で病原微生物が検出され、claudin欠損マウスの搬送ができなくなり、これらを用いた実験が一時中断したことや、それまでに搬送済のclaudin欠損マウスの数に限度があり、予定していた実験プロトコールの一部しか実施できなかったことが理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は、１）claudin欠損マウスの安定した供給を目的として、神戸大より供与された受精卵を用いて、自治医科大学動物センターでbreedingを行うための費用や、２）受精卵から生まれたclaudin遺伝子改変マウスを用いて、当初から予定していた実験を行うための費用に充当する予定である。既に受精卵から遺伝子改変マウスが生まれ、飼育中である。
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