2013 Fiscal Year Research-status Report
FUS/TLSのメチル化による核-細胞質シャトリング制御と凝集体形成機序の解明
| Project/Area Number |
25461267
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Research Institution | Chiba University |
|---|
Principal Investigator |
山口 淳 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00314336)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | ALS / 凝集体 / アルギニンメチル化 |
|---|
| Research Abstract |
当該研究は筋萎縮性側索硬化症(ALS; Amyotrophic lateral sclerosis)の発症機序解明のため、家族性ALSの原因遺伝子であるFUS/TLSの機能解析を行うものである。FUS/TLSは、核-細胞質シャトリングタンパク質であり通常は核内に局在するが、患者では細胞質に偏位し、凝集体を形成するため、このメカニズムの解明が重要である。当該研究では、(1)メチル化によるFUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構、(2)FUS/TLSによる凝集体の形成機序と意義 の解明を行っている。当該年度は、①TransportinとFUS/TLSの結合部位の同定、②各種メチル化阻害薬(AdOx,MTA, AMI-1)のFUS/TLS変異体P525L の細胞内局在への効果、③FUS/TLSのストレス顆粒形成を促進する各種ストレス(heat, oxidative, hypoxia, ER stress etc)の同定、④テトラサイクリン誘導性 FUS/TLS変異体発現系の作製のためのプラスミド構築 を行った。①に関しては、FUS/TLSのC端付近のRGG部位の欠損体を形成したところ、メチル化阻害薬の効果が消失したことからこの部位がTransportinとの結合部位であることが示唆された。②に関しては、汎メチル化阻害薬AdOx、MTAのFUS P525Lの細胞内局在への効果は顕著に認めたが、PRMT1特異的阻害薬であるAMI-1では効果は低レベルであった。③に関しては、ヒ素(Arsenite)、Sorbitolの投与時にFUS/TLSの著明なストレス顆粒形成を認めた。④に関しては、ドイツ(Dr.Dirk Grundemann、Cologne大学)よりテトラサイクリン誘導性発現系の構築用のプラスミド(pEBTet)を入手し、FUS/TLS変異体発現系のためのプラスミド構築を完了した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は、予定通りFUS/TLSとTransportinの結合部位の同定、各種メチル化阻害薬のFUS/TLS変異体への影響、ストレス顆粒形成を惹起するストレス同定を行い、また、テトラサイクリン誘導性のFUS/TLS変異体発現系の細胞株確立のためのプラスミド構築が終了した。課題としては、Transportinの結合部位の同定は予定通り進んだが、更に詳細な部位の同定が必要である。また、汎メチル化阻害薬の効果は解析が終了したが、汎メチル化阻害薬以外のPRMT1特異的なメチル化阻害薬の解析が必要である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず、昨年度に構築したテトラサイクリン誘導性 FUS/TLS変異体発現系のプラスミドを用いSH-SY5Y，NSC-34細胞株を確立する。その細胞株を用いて以下の研究計画を予定している。
(1) メチル化によるFUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構の解明
当該年度は、PRMT1特異的阻害薬の解析、メチル化が他のタンパク修飾(例：リン酸化)と相互作用する可能性や、脱メチル化酵素の存在を検証する。具体的な解析方法は、脱メチル化酵素の候補を挙げ、in vitro methylation assayでメチル化修飾の変化を解析する。また、タンパク修飾の各種阻害剤を投与し形態学的に細胞内局在の変化を解析する。
(2) FUS/TLSによる凝集体の形成機序と意義の解明
神経細胞由来のSH-SY5Y、NSC-34細胞によるtet-on inducible FUS/TLS P525L cell line を確立し、凝集体の形成時に惹起されるシグナル経路の解析、ストレス状態でのviabilityを解析する。また、凝集体のストレス顆粒マーカーとの局在や凝集形成に必要な部位の同定を行う。
|
