2013 Fiscal Year Research-status Report
孤発性ALSマウスモデルによる家族性遺伝子の分子連関の解明
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25461269
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山下 雄也 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任研究員 (20431843)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 神経細胞死 / TDP-43 / AMPA受容体 / ADAR2 / GluA2 / calpain / RNA編集 / 筋萎縮性側索硬化症 |
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| Research Abstract |
RNA編集酵素ADAR2の活性低下によるAMPA受容体サブユニットGluA2 Q/R部位のRNA編集低下、およびTDP-43陽性の細胞質封入体形成は孤発性ALS運動ニューロンに見られる疾患特異的分子変化である。ADAR2の発現が低下した運動ニューロンにおいてTDP-43の局在異常が観察され、TDP-43がカルパインにより切断され、N端領域が凝集体形成に関与することを報告した。カルパインによるTDP-43の切断点の同定を行う為、リコンビナントTDP-43をpCold系（タカラ）を用いることで合成し、カルパインにより切断したフラグメントをMALDI-TOF mass を用いて解析を行い、10の切断点を同定した。TDP-43フラグメントのウエスタンブロットの結果からメインの3つのN端フラグメントと１つのC端フラグメントを作成し、HeLa細胞に過剰発現後、凝集能と細胞死の検討を行った。プリオンドメインを含んだ2つの長いN端フラグメントは強い凝集性を示したが細胞死は見られなかった。一方短いN端フラグメント・C端フラグメントは凝集能・細胞死ともに観察されなかった。
またADAR2活性低下からTDP-43病理に至る分子カスケードが孤発性ALS運動ニューロンに働いていることは、AR2マウス運動ニューロンのADAR2 発現を遺伝子治療で回復することによりTDP-43の局在が正常化したことにより裏付けられた。
次にFUSがカルパインにより切断されることを培養細胞、マウスの脳・脊髄のin vitro カルパインアッセイにより確認できたので、切断部位の検討のために、Flagタグを付けたFUSのコンストラクトとFUS変異を導入したコンストラクトを作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TDP-43のカルパインによる切断点を同定し、そのN端フラグメントは強い凝集性を示すことがわかり、その結果を論文に発表した。さらに、孤発性ALSマウスを用いたADAR2活性を回復させる遺伝子治療実験において、ADAR2からTDP-43病理へ至る分子カスケードが孤発性ALS運動ニューロンの細胞死ではたらいていることが裏付けられ、その結果を論文に発表した。またFUSがカルパインにより切断されることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
カルパインによるTDP-43の切断点を同定しそのN端フラグメントが強い凝集性を示すことが分かった。またFUSもカルパインにより切断を受けることが明らかになった。この二つの遺伝子と他の孤発性筋萎縮性側索硬化症の関連遺伝子がどのようなつながりがあるのか、得られた結果を元に、神経細胞死カスケードについて、更に検討を行いたいと考える。
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