Optineurinによる筋萎縮性側索硬化症発症機序の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461280
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 永野 義人 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 助教 (50397973)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 哲也 広島大学, 大学病院, 講師 (00435942) ; 松本 昌泰 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 教授 (20192346)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 筋委縮性側索硬化症 / Optineurin / C2C12 / TRAF6 / autophagy

Research Abstract

この研究計画はOptineurinが筋委縮性側索硬化症(ALS)の発症機序にどのように関わるかを明らかにするものである。Optineurinはその点変異が家族性ALSの原因となることが報告されている。まず我々は筋委縮のモデルとなるマウス筋芽細胞C2C12を用いて、生化学的・細胞生物学的実験を行った。野生型および変異型Optineurinを強発現、もしくはsiRNAでOptineurin発現を抑制した細胞を用い、様々な筋委縮マーカーのmRNAレベルをRT-PCRで定量化することで評価した。その後、Optineurinがもう一つの筋委縮の調節因子であるユビキチンリガーゼTRAF6とどのように関わるかを免疫沈降法、ユビキチン化アッセイなどにより解析し、興味深い結果を得ている。さらにOptineurinはautophagy関連分子であるという報告もあることから、免疫染色法にてautophagyマーカー(LC3, p62, Beclin1)との局在を評価した。これらの培養細胞を用いた研究から、Optineurinが筋委縮を引き起こす重要な分子であり、autophagyによる蛋白分解が筋委縮を引き起こす可能性が示唆された。現在、次の段階としてin vivoでのOptineurinの機能評価を脱神経モデルマウスを用いて行う予定であり、その予備的実験として筋内にOptineurinのsiRNAをelectroporationにより遺伝子導入し、筋内のOptineurinの発現が抑制されるか条件検討を重ねている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度内に終了する予定の研究で既報にあるOptineurinに関連するNF-κB活性の評価が行われていないが、次年度以降に予定であった脱神経モデルマウスを使用したin vivo実験をすでに開始しており、進行はおおむね順調と考える。

Strategy for Future Research Activity

今後の予定としては、脱神経モデルマウスを用いたin vivoでのOptineurinの機能評価を行う予定である。マウスの前脛骨筋にelectroporationにてsiRNAを遺伝子導入し、その後外科的に坐骨神経を切除させ、顕微鏡にて筋委縮の程度の評価する。同時に委縮が起こった筋肉内でのautophagy活性やOptineurinのユビキチン化を生化学的に解析する予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

初年度購入予定であった遺伝子導入装置は広島大学に既存の装置で代用して予備実験を行ったため購入しなかった。そのために次年度使用額が生じた。
今年度は昨年度予定していた遺伝子導入装置を購入する予定である。そのほか実験用マウス、抗体、試薬の購入に使用する予定である。