2段階モデルに基づく新規パーキンソン病マウスの確立

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461291
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 舩山 学 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70468578)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: CHCHD2 / NDUFV2 / ミトコンドリア / 電子伝達系 / パーキンソン病

Outline of Annual Research Achievements

申請者はパーキンソン病の新規原因遺伝子を単離した (26年度新学術領域研究研究成果) た。新規原因遺伝子はCHCHD2であり、ミトコンドリアに局在し、電子伝達系の調節因子である可能性が指摘されている。本研究課題のNDUFV2もミトコンドリア複合体Iのサブユニットであるためこの2つの遺伝子はパーキンソン病においてミトコンドリアという場で関連している可能性を検討するため、CHCHD2の遺伝子改変マウスの作出に着手した。CHCHD2遺伝子変異は常染色体優性遺伝性であるため、ヒトCHCHD2のパーキンソン病原因遺伝子変異T61Iを過剰発現するマウスを作出することを計画した。全身に発現するCAGプロモーターと神経特異的に発現するPrPプロモーターの下流に野生型CHCHD2またはCHCHD2-T61I変異体を連結したベクターを構築した。まず、発現を確認する目的で、HeLa細胞に4種類 (CAG-CHCHD2-WT, CAG-CHCHD2-MT, PrP-CHCHD2-WT, PrP-CHCHD2-MT) のベクターを強発現し、ウエスタンブロットでその発現を確認した。4種類のベクターとも発現が確認できた。今後マウス受精卵に遺伝子を導入し、ヒトCHCHD2トランスジェニックマウスを作出する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画とは異なる遺伝子改変マウス作出に着手したが、新たに作出に着手した標的遺伝子であるCHCHD2は(1) 新規の遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子であり、(2) 研究代表者が世界に先駆けて単離した遺伝子であり、(3) ミトコンドリアの膜間腔に局在することが明らかになっており、 (4) in vitroのノックダウン実験ではミトコンドリア呼吸鎖複合体IVの構成タンパク質群とその活性が低下することが海外の研究グループから報告されている。したがって本研究課題の「新規パーキンソン病モデルマウス作製」という最終目的を達成するために、CHCHD2の遺伝子改変マウスの作出を優先して実施することが最善であると判断した。
平成26年度内に (1) ヒトCHCHD2cDNAのクローニング、(2) 遺伝子改変マウス作製用ベクター (全身発現と神経特異的発現の2種類)、(3) 研究代表者が発見したパーキンソン病の発症原因となる遺伝子変異の導入、(4) コンストラクションを終えたベクターの発現確認 (HeLa細胞に強発現しウエスタンブロットで検出) を全て完了し、27年度へ向けて遺伝子改変マウス作出の準備を全て終えることができた。沿って本研究は順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

26年度に作製したベクターをマイクロインジェクションによりC57BL/6マウス由来受精卵に注入した後、偽妊娠させたICRマウスの卵管に移植する。マイクロインジェクションにより得られた子マウスをPCR法により導入遺伝子の検定を行いF0マウスを得る。F0マウスと野生型 (C57BL/6)マウスを交配させF1マウスを得る。F1マウスを戻し交配すると同時に下記(実験2)のとおり生化学的・形態学的観察、および行動解析を行う。
遺伝子改変のみでは表現型が得られない場合の具体的な解析の一例 (計画) としてはMPTP投与および脳虚血-再灌流モデルがある。MPTPはドーパミン神経細胞特異的に障害を引き起こす神経毒で広くパーキンソン病のモデルとして使われている。これを作出したマウスに投与し、行動解析、免疫組織学的解析、生化学的解析を行う。しかしながらMPTPはミトコンドリア複合体Iの阻害剤と考えられており、本マウス (複合体IVに関与) との関与が明らかでない。そこで、培養細胞をもちいた先行論文で報告がある、低酸素負荷との関与を観察するために脳虚血-再灌流モデルを作製する。脳虚血-再灌流モデルマウスはC57BL/6Jマウス頸動脈からナイロン糸を挿入し中大脳動脈を閉塞-血流再開することで作成する。さらに脳虚血-再灌流モデルマウス脳切片を用いて免疫染色を実施し、CHCHD2の脳内における分布を観察する。

Causes of Carryover

計画を一部変更し新規パーキンソン病遺伝子改変マウスの作出に着手したため

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度前期中にマウス作出が完了する予定のため、次年度使用額分はその解析費用に充てる

Research Products

• [Journal Article] ABCG2 variant has opposing effects on ages at onset of Parkinson’s disease and gout. (2015)
  • Author(s): Matsuo H, Tomiyama H, Satake W, Chiba T, Onoue H, Kawamura Y, Nakayama A, Shimizu S, Sakiyama M, Funayama M, Nishioka K, Shimizu T, Kaida K, Kamakura K, Toda T, Hattori N, Shinomiya N.
  • Journal Title: Ann Clin Transl Neurol. Volume: 2 Pages: 302-306
  • DOI: 10.1002/acn3.167
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Possible involvement of iron-induced oxidative insults in neurodegeneration. (2015)
  • Author(s): Asano T, Koike M, Sakata S, Takeda Y, Nakagawa T, Hatano T, Ohashi S, Funayama M, Yoshimi K, Asanuma M, Toyokuni S, Mochizuki H, Uchiyama Y, Hattori N, Iwai K.
  • Journal Title: Neurosci Lett. Volume: 588 Pages: 29-35
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2014.12.052.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High frequency of beta-propeller protein-associated neurodegeneration (BPAN) among patients with intellectual disability and young-onset parkinsonism. (2015)
  • Author(s): Nishioka K, Oyama G, Yoshino H, Li Y, Matsushima T, Takeuchi C, Mochizuki Y, Mori-Yoshimura M, Murata M, Yamasita C, Nakamura N, Konishi Y, Ohi K, Ichikawa K, Terada T, Obi T, Funayama M, Saiki S, Hattori N.
  • Journal Title: Neurobiol Aging. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2015.01.020.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] CHCHD2 mutations in autosomal dominant late-onset Parkinson’s disease: a genome-wide linkage and sequencing study. (2015)
  • Author(s): Funayama M, Ohe K, Amo T, Furuya N, Yamaguchi J, Saiki S, Yuanzhe L, Ogaki K, Ando M, Yoshinon H, Tomiyama H, Nishioka K, Hasegawa K, Saiki H, Satake W, Mogushi K, Sasaki R, Kokubo Y, Kuzuhara S, Toda T, Mizuno Y, Uchiyama Y, Ohno K, Hattori N.
  • Journal Title: LANCET Neurology. Volume: 14 Pages: 274-282
  • DOI: 10.1016/S1474-4422(14)70266-2.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of a Japanese family with LRRK2 p.R1441G-related Parkinson's disease. (2014)
  • Author(s): Hatano T, Funayama M, Kubo S, Mata IF, Oji Y, Mori A, Zabetian CP, Waldherr SM, Yoshino H, Oyama G, Shimo Y, Fujimoto K, Oshima H, Kunii Y, Yabe H, Mizuno Y, Hattori N.
  • Journal Title: Neurobiol Aging. Volume: 35 Pages: 2656.e17-23
  • DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.05.025.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] EIF4G1 gene mutations are not a common cause of Parkinson's disease in the Japanese population. (2014)
  • Author(s): Nishioka K, Funayama M, Vilarino-Guell C, Ogaki K, Li Y, Sasaki R, Kokubo Y, Kuzuhara S, Kachergus JM, Cobb SA, Takahashi H, Mizuno Y, Farrer MJ, Ross OA, Hattori N.
  • Journal Title: Parkinsonism Relat Disord. Volume: 20 Pages: 659-661
  • DOI: 10.1016/j.parkreldis.2014.03.004.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Juvenile-onset parkinsonism with digenic parkin and PINK1 mutations treated with subthalamic nucleus stimulation at 45 years after disease onset. (2014)
  • Author(s): Nakahara K, Ueda M, Yamada K, Koide T, Yoshimochi G, Funayama M, Kim JH, Yamakawa S, Mori A, Misumi Y, Uyama E, Hattori N, Ando Y.
  • Journal Title: J Neurol Sci. Volume: 15 Pages: 276-277
  • DOI: 10.1016/j.jns.2014.07.053.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ミトコンドリア呼吸鎖複合体に着目した新規パーキンソン病モデルマウスの解析. (2014)
  • Author(s): 舩山 学, 服部 信孝.
  • Organizer: 第55回日本神経病理学会総会学術研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-06-06 – 2014-06-06
• [Remarks] 遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子を新たに発見
  • URL: http://www.juntendo.ac.jp/graduate/pdf/news15.pdf