2013 Fiscal Year Research-status Report

賦活脂肪組織によるアルツハイマー型認知症の幹細胞動員修復機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25461331
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	黒田正幸千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (00253005)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	窪田吉孝千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (10375735)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	アルツハイマー病 / 脂肪細胞 / 脂肪幹細胞 / ネプリライシン / BDNF
Research Abstract	既報ではBDNFは血小板に存在するとされているため、健常人の血小板についてBDNFが検出されるかどうかを検討した。申請者らが過去に報告している方法に基づいて健常人より調製した血小板で、BDNFが検出された。BDNFは翻訳後修飾を受け、proBDNFが成熟型に変換される。今回検出できたBDNFのシグナルはproBDNFと類似のサイズに検出された。従って、BDNFが本研究で解明を目指す感知機構に関与するのであれば、proBDNFからBDNFへの変換が血小板から放出される際に起きる可能性がある。一方、Aβの濃度感知機構についてはAβ1-40とAβ1-42について検討を行ったところ、ASC、ccdPAともに濃度依存的な増殖阻害が認められた。 Aβ分解酵素群の中で、アルツハイマー型認知症の病態に最も重要な影響を与えると考えられるネプリライシンのASC、ccdPAにおける機能解析を行うため、レンチウイルスベクターによるshRNA導入系を確立した。5つのデザインされたshRNA配列とpuromycin耐性遺伝子を搭載するレンチウイルスベクターを作製し、ASC、ccdPAに遺伝子導入した。その後、それぞれの細胞におけるネプリライシンmRNAを定量PCRにより測定した。同時に、ネプリライシンの産生量をフローサイトメトリー、細胞抽出液のウェスタンブロットにより評価した。5種類のshRNA配列のうち、1種類のshRNAが効率良くネプリライシンの発現を抑制することが分かった。他方、ネプリライシン発現レンチウイルスベクターの構築を行った。その過程で既報を基に膜貫通ドメインを欠失したコンストラクトの構築を行ったが、細胞外への分泌が確認されず、現在、異なるコンストラクトの構築を行っている。これらの解析を通じて、ネプリライシンのmRNA量、タンパク量の評価が可能となった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初、BDNFは血小板で成熟型として存在すると考えていたが、血小板にはproBDNFに類似のサイズのバンドが検出され、血小板により伝達されるシグナルがproBDNFによるものである可能性も考えられた。また、2種類の市販のAβによるASCとccdPAの増殖阻害実験を行った結果、両細胞はほぼ同じ濃度で細胞障害がおこることが示された。以上の結果からASCとccdPAのAβに対する応答性は増殖実験だけでは評価できず、細胞が存在する局所でのBDNF濃度との相加的・相乗的効果による可能性、もしくは、同一濃度においても細胞の活性化に関与する遺伝子発現の状態に相違が見られる可能性が示唆された。このようにBDNFの血小板における翻訳後修飾の状態が不明であったこと、ASCとccdPAの相違がAβの濃度のみでは評価できないことからこれらの背景についての検討が必要であり、研究方針に大きな変更は生じないが、詳細な解析の追加を考慮する必要性が出てきた。
Strategy for Future Research Activity	H26年度も引き続き、BDNF、Aβ濃度の感知機構を解明するための機能解析として以下の検討を進める予定である。 H25年度の研究結果から、血小板に存在するBDNF（proBDNF）とAβの両者の濃度バランスがASC活性化に重要な役割を果たす可能性が示唆されるため、H26年度はin vitroでのアッセイ系で血小板由来BDNFやAβの濃度に依存した遺伝子発現プロファイルの変化を検討し、アルツハイマー病態関連液性因子の濃度に依存したASCの活性化機構を担う中心的な分子の同定を進める予定である。同時に血液脳関門（BBB）をASCが通過するかどうかについては、乳がん細胞の転移モデルで報告されているin vitro評価系を導入し、ASCの機能解析を行う。近年認知症等の病態でBBBが障害されていることが報告されており、そのような報告における分子メカニズムを参照して進める予定である。