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2013 Fiscal Year Research-status Report

カルシウムセンサーDOC2bのリン酸化を介する小胞膜融合調節機構

Research Project

Project/Area Number 25461356
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionYamaguchi University

Principal Investigator

福田 尚文  山口大学, 医学部附属病院, 助教 (50566867)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 谷澤 幸生  山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00217142)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
KeywordsGLUT4 / DOC2b / PKC
Research Abstract

1.DOC2bリン酸化シグナルを解明する。培養細胞の検討からDOC2bが細胞膜でカルシウムセンサー蛋白として働くためには、DOC2bのN端にあるMID domainがリン酸化を受ける必要があると考えられる。我々はインスリンシグナルの下流に存在するDOC2bリン酸化シグナルについて解明する試みを行った。
(1)DOC2bのリン酸化部位を同定
DOC2b MID domainのデータベースを基に候補となるセリン残基に変異を加えた変異体を作製し野生型と比較検討した結果、DOC2b MID domainのセリン残基がインスリン刺激によって特異的にリン酸化されることを確認した。またその変異体を培養細胞に発現させるとDOC2bの細胞膜融合させる作用が消失するため、このリン酸化はDOC2bの機能を果たすために必要であることがわかった。
(2)DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定した。
次にDOC2b MID domainのリン酸化モチーフより上流因子としてセリン・スレオニンキナーゼを想定し、候補となったPKC ファミリーとDOC2bの免疫沈降実験を行った。その結果、PKCの一つが、DOC2bとインスリン存在下で特異的に結合した。よってインスリン存在下でPKCがDOC2bをリン酸化することがわかった。これらの結果から目的としていたインスリンによるDOC2bリン酸化シグナルの重要な部分は解明できたと考えている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画書で設定した平成25年度の実験計画の(1)DOC2bのリン酸化部位を同定する。についてはDOC2b MID domainのデータベースを基に候補となるセリン残基に変異を加えた変異体を作製し、DOC2bリン酸化抗体で認識するかを検討し、特異的なセリン残基がリン酸化されることを確認できた。(2)DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定する。についてもPKCとDOC2bの免疫沈降実験で結合を確認できたので、DOC2bリン酸化シグナルを解明するという目的は概ね果たせたと考える。

Strategy for Future Research Activity

DOC2bリン酸化による細胞膜融合の可視化と細胞膜融合促進因子の検討。
DOC2bリン酸化が細胞膜融合に与える影響を全反射蛍光(TIRF)顕微鏡で観察する。Glut4小胞内存在するIRAP (insulin-regulated aminopeptidase)にpHluorin (pH sensitive GFP tag) をつけたコンストラクトを脂肪細胞に過剰発現させ、Glut4小胞が細胞膜融合すると、小胞内のpHが変化し、pHluorinが発色し、それをTIRF顕微鏡で観察する方法が開発された(M Jennine et al, PLOS ONE 2012)。この手法を用いてインスリン刺激下でGlut4小胞の細胞膜融合を経時的かつ定量的に観察できる方法を確立する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

今回平成25年度に計画していた実験が順調に進展したことから、当初予定していた実験試薬や消耗品等を低額に抑えることができたため次年度使用額が生じた。
次年度、培養細胞の継代やウイルス作成、動物飼育費と併せて使用する。

  • Research Products

    (5 results)

All 2013

All Presentation (5 results)

  • [Presentation] DOC2b regulates glucose homeostasis through insulin mediated aPKC activation and GLUT4 vesicle fusion.2013

    • Author(s)
      野見山隆太 江本政広 福田尚文 松井久未子 谷澤幸生  坂根亜由子 佐々木卓也 三好淳
    • Organizer
      2013年ICDM&第5回AASD
    • Place of Presentation
      韓国(ソウル)
    • Year and Date
      20131207-20131210
  • [Presentation] GLUT4 vesicle fusion regulator DOC2b is required for systemic glucose homeostasis.2013

    • Author(s)
      野見山隆太 江本政広 福田尚文 松井久未子 谷澤幸生  坂根亜由子 佐々木卓也 三好淳
    • Organizer
      International Diabetes Federation 2013
    • Place of Presentation
      オーストラリア(メルボルン)
    • Year and Date
      20131202-20131206
  • [Presentation] aPKCはSNARE調節因子DOC2bの機能発現に必要である2013

    • Author(s)
      野見山隆太 江本政広 福田尚文 松井久未子 谷澤幸生
    • Organizer
      第51回日本糖尿病学会中国四国地方会
    • Place of Presentation
      岡山市(岡山コンベンションセンター)
    • Year and Date
      20131115-20131116
  • [Presentation] SNARE調節因子Doc2bの糖恒常性維持における役割2013

    • Author(s)
      野見山隆太 江本政広 福田尚文 松井久未子 谷澤幸生  坂根亜由子 佐々木卓也 三好淳
    • Organizer
      第63回日本体質医学会総会
    • Place of Presentation
      久留米市(久留米大学筑水会館)
    • Year and Date
      20131005-20131006
  • [Presentation] SNARE関連蛋白質Doc2bの糖代謝への役割2013

    • Author(s)
      野見山隆太 江本政広 福田尚文 松井久未子 谷澤幸生  坂根亜由子 佐々木卓也 三好淳
    • Organizer
      第56回糖尿病学会年次学術集会
    • Place of Presentation
      熊本市(ホテル日航熊本)
    • Year and Date
      20130516-20130518

URL: 

Published: 2015-05-28  

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