2014 Fiscal Year Research-status Report
カルシウムセンサーDOC2ｂのリン酸化を介する小胞膜融合調節機構
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25461356
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
福田 尚文 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (50566867)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷澤 幸生 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00217142)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Glut4 / DOC2b / PKC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.DOC2bリン酸化シグナルを解明する。培養細胞の検討からDOC2bが細胞膜でカルシウムセンサー蛋白として働くためには、DOC2bのN端にあるMID domainがリン酸化を受ける必要があると考えられる。我々はインスリンシグナルの下流に存在するDOC2bリン酸化シグナルについて解明する試みを行った。
「A.DOC2bのリン酸化部位を同定」DOC2b MID domainのデータベースを基に候補となるセリン残基に変異を加えた変異体を作製し野生型と比較検討した結果、DOC2b MID domainのセリン残基がインスリン刺激によって特異的にリン酸化されることを確認した。またその変異体を培養細胞に発現させるとDOC2bの細胞膜融合させる作用が消失するため、このリン酸化はDOC2bの機能を果たすために必要であることがわかった。
「B.DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定」次にDOC2b MID domainのリン酸化モチーフより上流因子としてセリン・スレオニンキナーゼを想定し、候補となったPKCファミリーとDOC2bの免疫沈降実験を行った。その結果、PKCの一つが、DOC2bとインスリン存在下で特異的に結合した。よってインスリン存在下でPKCがDOC2bをリン酸化することがわかった。これらの結果から目的としていたインスリンによるDOC2bリン酸化シグナルの重要な部分は解明できたと考えている。
2.DOC2bリン酸化による細胞膜融合の可視化
DOC2bリン酸化が細胞膜融合に与える影響を全反射蛍光(TIRF)顕微鏡で観察するために、Glut4小胞内に存在するIRAP(insulin-regulated aminopeptidase)にpHluorin(pH sensitive GFP tag)をつけたコンストラクトを作成。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成25年度の実験計画である1.DOC2bのリン酸化部位を同定する。2.DOC2bのリン酸化シグナルの上流因子を同定する。については上流因子であるPKCがDOC2bのMID domainを特異的にリン酸化することを確認し、目的は概ね達成された。
平成26年度の実験計画であるDOC2bリン酸化による細胞膜融合の可視化と細胞膜融合促進因子の検討については、現在Glut4小胞内存在するIRAP (insulin-regulated aminopeptidase) にpHluorin (pH sensitive GFP tag) をつけたコンストラクトを作成中であり、脂肪細胞内に強制発現させて全反射蛍光(TIRF)顕微鏡で観察する。には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
DOC2bリン酸化による細胞膜融合の可視化と細胞膜融合促進因子の検討。
Glut4小胞の細胞膜融合についても、Glut4小胞内存在するIRAP (insulin-regulated aminopeptidase) にpHluorin (pH sensitive GFP tag) をつけたコンストラクトを完成させ、脂肪細胞に過剰発現させて、Glut4小胞が細胞膜融合すると、小胞内のpHが変化し、pHluorinが発色し、それをTIRF顕微鏡で観察する方法を用いてインスリン刺激下でGlut4小胞の細胞膜融合を経時的かつ定量的に観察できる方法を確立する。
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