2015 Fiscal Year Annual Research Report
カルシウムセンサーDOC2ｂのリン酸化を介する小胞膜融合調節機構
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25461356
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
福田 尚文 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (50566867)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷澤 幸生 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00217142)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Glut4 / DOC2b / PKC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．DOC2bリン酸化シグナルを解明する。培養細胞の検討からDOC2bが細胞膜でカルシウムセンサー蛋白として働くためには、DOC2bのN端にあるMID domainがリン酸化を受ける必要があると考えられる。我々はインスリンシグナルの下流に存在するDOC2bリン酸化シグナルについて解明する試みを行った。
「A.DOC2bのリン酸化部位を同定」DOC2b MID domainのデータベースを基に候補となるセリン残基に変異を加えた変異体を作製し野生型と比較検討した結果、DOC2b MID domainのセリン残基がインスリン刺激によって特異的にリン酸化されることを確認した。またその変異体を培養細胞に発現させるとDOC2bの細胞膜融合がさせる作用が消失するため、このリン酸化はDOC2bの機能を果たすために必要であることがわかった。
「B.DOC2bリン酸化シグナルの上流因子を同定」次にDOC2b MID domainのリン酸化モチーフより上流因子としてセリン・スレオニンキナーゼを想定し、候補となっていたPKCファミリーとDOC2bの免疫沈降実験を行った。その結果、PKCの一つが、DOC2bとインスリン存在下で特異的に結合した。よってインスリン存在下でPKCがDOC2bをリン酸化することがわかった。これらの結果から目的としていたインスリンによるDOC2bリン酸化シグナルの重要な部分は解明できたと考えている。
２．DOC2bリン酸化による細胞膜融合の可視化
DOC2bリン酸化が細胞膜融合に与える影響を全反射蛍光(TIRF)顕微鏡で観察するために、Glut4小胞内に存在するIRAP(insulin-regulated aminopeptidase)にpHluorin(pH sensitive GFP tag)をつけたコンストラクトを作製し、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡で観察を行った。
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